本申请提供了用于核酸测序或扩增和检测的改进方法，所述方法包括下列步骤：i）提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸，ii）提供酶和试剂，其使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸的，iii）将反应组分在适合于靶核酸引物的扩增的条件下温育，iv）通过标记的核苷酸检测扩增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列：5’-NaXNb-3’，其中N可以是任意核苷酸，其中“a”和“b”表示核苷酸数量，并且可以在1至150的范围内，并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。此外，本文还公开了包含这样的核酸引物的试剂盒，以及所述试剂盒或核酸引物在用于核酸测序或扩增和检测的方法中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术属于生物学和化学领域，特别是分子生物学领域。更具体来说，本专利技术涉及用于核酸测序或扩增和检测的方法和试剂盒。专利技术背景如今，分子方法在诊断学和鉴定个体，例如在法医学领域或亲子鉴定中发挥重要作用。靶区域的扩增是这些方法中的中心程序。此外，方法包括在大多数情况下通过凝胶电泳如毛细管电泳来分析被扩增靶区域的长度。被扩增材料的分析通过荧光标记物的检测来进行。将标记物附连到用于扩增的位点特异性引物的5’-末端。然而，当分析扩增产物时，小的干扰性人为峰、即所谓的“染料污迹(dye blobs)”的出现，导致基线具有高的“背景噪音”，这干扰了方法的灵敏度。“染料污迹”是电泳图中不代表特异性扩增产物，而是代表包含标记物的降解产物的峰。造成它们的分子是游离的荧光染料标记物以及与标记物相连的1-Sbp长的寡核苷酸。后者可能代表降解的引物或降解的PCR产物。现在，本专利技术人出人意料地发现，内部标记的寡核苷酸引物的使用减少了染料污迹的出现。因此，本申请提供了用于测序或扩增和检测核酸的方法，所述方法包括使用内部标记的核酸引物。使用内部标记的引物的技术效果是提供了具有更高灵敏度的方法。专利技术描述因此，本专利技术解决了上面提到的问题，并提供了用于测序或扩增和检测核酸的方法，所述方法包括下列步骤:i)提供至少一种核酸引物`，其包含至少一个标记的核苷酸，ii)提供酶和试剂，其使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸，iii)将反应组分在适合于靶核酸引物的扩增的条件下温育，iv)通过标记的核苷酸来检测扩增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列:5，-NaXNb_3，，其中N可以是任意核苷酸或修饰的核苷酸，其中a和b表示核苷酸数量，并可以在I至150的范围内；并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。在本文中，“核酸引物”是指适用于扩增的寡核苷酸。本领域技术人员应该理解，为了适用于扩增，3’ -末端应该可以通过聚合酶进行延伸。核酸引物可以使用任何适合的方法来制备，例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化实施方式。在一种这样的自动化实施方式中，使用二乙基-亚磷酰胺作为起始原料，其可以如Beaucage等，TetrahedronLetters, 22:1859-1862 (1981)所述进行合成，该文献通过引用并入本文。一种在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法描述在美国专利号4，458，006中，所述专利通过引用并入本文。还可以使用从生物样品(例如限制性内切酶消化物)分离的引物。核酸引物的长度可以各不相同。长度可以适应于需要。在本专利技术的方法的情形中，“核酸”是指样品中特定类型的核酸，尤其是RNA、DNA、cDNA (互补 DNA)、LNA (锁核酸)、mRNA (信使 RNA)、mtRNA (线粒体的)、rRNA (核糖体 RNA)、tRNA (转运 RNA)、nRNA (核 RNA)、siRNA (短干扰 RNA)、snRNA (小核 RNA)、snoRNA (小核仁RNA)、scaRNA (小卡哈尔体特异性RNA)、microRNA、dsRNA (双链RNA)、核酶、核糖开关、病毒RNA、dsDNA (双链 DNA)、ssDNA (单链 DNA)、质粒 DNA、粘粒 DNA、染色体 DNA、病毒 DNAmtDNA(线粒体DNA)、nDNA (核DNA)、或snDNA (小核DNA)等，或可以与样品中主体核酸区分开的任何其他类型或亚类的核酸。本专利技术人发现，使用内部标记的核酸引物导致引起染料污迹的片段减少。如果扩增产物在检测之前必须按照其长度进行分离，则染料污迹是特别不想要的。因此，在本专利技术方法的一种实施方式中，步骤iv)优选地在通过标记的核苷酸检测扩增的核酸之前，包括按照长度分离扩增的核酸的步骤。本领域技术人员了解按照核酸长度分离核酸的大量方法。一种常用方法是凝胶电泳。因此，在本专利技术的一种实施方式中，使用凝胶电泳对扩增的核酸按照其大小进行分离。凝胶电泳是使用施加于凝胶基质的电场来分离核酸分子的技术。术语“凝胶”是指用于包含、然后分离靶分子的基质。在大多数情况下，凝胶是交联聚合物，其组成和孔隙度根据待分析的靶的具体重量/长度和组成来选择。当分离小核酸(DNA、RNA或寡核苷酸)时，凝胶通常由不同浓度的丙烯酰胺和交联剂构成，产生不同网孔尺寸的聚丙烯酰胺网状物。丙烯酰胺可以是例如丙烯酰胺、直链聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺或聚异丙基丙烯酰胺。当分离较大核酸(大于几百碱基)时，可以选择纯化的琼脂糖作为基质。在两种情形中，凝胶形成固体但有孔的基质。琼脂糖由没有交联的不带电荷的糖类的无分支长链构成，产生具有大孔的凝胶，允许分离大分子和大分子复合物。因此，在本专利技术的一种实施方式中，用于分离核酸的基质是聚丙烯酰胺或琼脂糖。凝胶电泳使用在法医学、分子生物学、遗传学、微生物学和生物化学中。通过用成像装置将凝胶中标记的核酸可视化，可以对结果进行定量分析，所述成像装置通常包含激发标记物荧光的光源，例如激光。用检测装置记录来自于标记物的信号，并测量条带或斑点的强度。测量和分析大多使用专门的软件来进行，所述软件将检测到的信号按照核酸的长度和被检测核酸的量转变成电泳图。在本专利技术的优选实施方式中，扩增的核酸的分离通过毛细管凝胶电泳来进行。此外，本领域技术人员了解在内部位置标记寡核苷酸的方法。一种可能方法是将标记物附连于核碱基，例如核碱基的环外氨基(在本文中也称为胺基)，另一种可能方法是将标记物附连于糖的2’ -碳。“环外”是指位于环状化学结构的环外部的基团，例如环的一部分取代基对于环来说是环外的。当在本文中使用时，环外胺基是指作为杂环碱基的环的取代基的胺基，并包括胺基的氮直接附连于环结构的成员的实施方式，还包括胺基的氮可以通过居间基团连接到杂环碱基的环结构的实施方式。此外，可以将标记物连接到2’ -修饰的核苷酸，例如，将胺基直接附连于糖的2’ -碳，或者胺基的氮可以通过居间基团连接到糖的2’ -碳。在本专利技术的一种实施方式中，将标记物通过环外胺基连接到所述被标记核苷酸(X)或连接到所述被标记核苷酸(X)的修饰的2’ -位置。在优选实施方式中，将标记物连接到被标记核苷酸(X)的环外氨基。在优选实施方式中，将标记物连接到胸腺嘧啶的环外胺基。标记寡核苷酸的可能方法对于专业技术人员来说是已知的，包括但不限于氨基-修饰物-C6’-dT CEP (例如5-[N-(三氟乙酰基氨基己基)-3-丙烯酰亚胺基]，也称为5- [E-2- [N- [6- (二氟乙酰胺基)己基]甲酰胺基]乙烯基])、氨基-修饰物-C2-dT CEP、5-氨基烯丙基-dU CEP、氨基-修饰物-C6-dA CEP、氨基-修饰物-C6_dGCEP (例如3’-0-[( 二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]_5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-[( 二甲基氨基)亚甲基]-N8-[6-(三氟乙酰基氨基)己基]-2’-脱氧鸟苷)、氨基-修饰物-15-dT CEP (例如3’-0-[( 二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5’ -0-(4, 4? - 二甲氧基三苯甲基)-5-[E-2’ _[N-[15-(三氟乙酰胺基)-7-氮杂-10，13-二氧杂-8-氧基十五烷基]甲酸胺基]乙烯基]-2’-脱氧尿本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.06 EP 11165142.81.一种用于核酸测序或扩增和检测的方法，所述方法包括下列步骤: i)提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸， ii)提供酶和试剂，使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸， iii)将反应组分在适合于靶核酸引物扩增的条件下温育， iv)通过标记的核苷酸来检测扩增的核酸， 其中所述核酸引物包含下列序列:5，-NaXNb-3，， 其中N可以是任意核苷酸， 其中“a”和“b”表示核苷酸的数量并且可以在I至150的范围内，并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。2.权利要求1的方法，其中步骤iv)包括按照大小分离所述扩增的核酸的步骤。3.权利要求1或2的方法，其中标记物通过核苷酸的环外氨基或2’-氨基连接到所述核苷酸。4.权利要求1至3任一项的方法，其中“a”在3至25之间。5.权利要求1至4任一项的方法，其中“b”在3至25之间。6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述核酸引物具有10至300nt的长度。7.权利要求1至6任一项的方法，其中标记物选自由荧光团、生色团、放射性同位素和化学发光物构成的标记物组，并且所述荧光团组包含5-或6-羧基荧光素(FAM?)、VIC?、NED?、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3?、CY5?、CY3.5?、CY5.5?、Cy7?、氧杂蒽、6-羧基-2’，4，，7，，4，7-六氯荧光素(HEX)、6_ 羧基-1，4-二氯-2’，7’ - 二氯-荧光素(TET?)、6-羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基荧光素(JOE?)、N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA?)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G (R6G5)、6-羧基罗丹明-6G (RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、罗丹明6G^、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲酰亚胺类例如Hoechst33258、菲啶类例如德克萨斯红?、加利福尼亚红?、雅吉瓦黄、A:k'xa Fluor? 350、Alexa Fluor?.405、Alexa Fluor? 430、Alexa Fluor?488、Alexa Fluor? i5()0、Alexa Fluor? 514、Alexa Fluor?532、Alexa Fluor?546、Alexa Fluor? W、Alexa Fluor? 568> Alexa Fluor? 594、Alexa Fluor? 610>Alexa Fluor? 633、Alexa Fluor? 647、Alexa Fluor? 660、Alexa Fluor? 680、Alexa Fluor? 700、Alexa Fluor? 750、PET?、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、Atto390、Atto425、Atto465、Atto488、Atto495、Atto520、Atto532、Atto550、Atto565...
【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰切斯卡·迪帕斯奎尔，丹尼尔·米勒，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：
国别省市：
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