富集囊泡RNA的方法技术

本发明专利技术涉及用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外核酸例如囊泡RNA的方法和试剂盒。根据所述方法制备了酸性结合混合物，其包含所述样品和阴离子交换粒子，并将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换粒子。在将包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换粒子从剩余混合物中分离出来之后，将结合的细胞外囊泡在至少一种去污剂存在下裂解，并将释放的RNA结合到所述阴离子交换粒子。然后从裂解物洗脱带有结合的RNA的阴离子交换粒子。阴离子交换粒子。

Methods of enriching vesicular RNA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】富集囊泡RNA的方法


[0001]本专利技术涉及用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外RNA的方法和试剂盒。具体来说，公开了用于从包含细胞外囊泡的样品直接富集细胞外核酸例如细胞外RNA的方法。

技术介绍

[0002]来自于细胞外囊泡(EV)的分析物，特别是细胞外RNA(在本文中也被称为“无细胞”或“cfRNA”)与诊断和研究目的相关。阴离子交换基质例如膜可用于从生物样品、特别是无细胞生物流体例如血浆、血清或尿液捕获EV(参见EP 2 941 629B1和WO 2017/197399以及来自于QIAGEN的exoRNeasy试剂盒)。这些结合基质的缺点在于洗脱通常使用高盐浓度进行，这使得在不进行进一步的耗时且复杂的净化工作流程的情况下，洗脱液与大多数下游应用不相容。或者，带有伯氨、仲氨和/或叔氨基作为功能组成部分的阴离子交换基质也可以在高pH下，通常在高于10的pH值下洗脱，但这对RNA完整性有害。因此，现有产品如exoRNeasy使用合并的裂解和洗脱步骤，其使用含有高盐浓度例如硫氰酸胍或硫氰酸钠和苯酚的QIAzol。在用QIAzol洗脱后进行特别是使用氯仿的有机萃取，并在硅胶基质(例如RNeasy柱或MAS G珠子)上进行RNA净化。
[0003]对用于从包含细胞外囊泡的样品富集并因此分离细胞外RNA的其他方法，存在着不断增长的兴趣和需求。具体来说，对用于分离包含囊泡RNA的细胞外RNA的改进的方法，存在着需求。
[0004]本公开的一个目的是提供一种避免现有技术的缺点的方法。具体来说，一个目的是提供比现有技术工作流程耗时更少的从细胞外囊泡分离RNA的方法。另一个目的是提供一种在分离细胞外RNA例如囊泡RNA后避免繁琐和复杂的净化流程的方法。

技术实现思路

[0005]本公开是基于下述发现，即细胞外囊泡可以被结合到阴离子交换粒子，并随后在促进从所述细胞外囊泡释放出的细胞外RNA的即时再结合的条件下高效裂解。结果，所述细胞外囊泡不需使用高盐和/或基于苯酚的洗脱溶液洗脱并提取，然后进行RNA富集流程。所释放的囊泡RNA可以通过结合到最初用于结合所述细胞外囊泡的阴离子交换粒子直接富集。由此提供了一种用于将细胞外囊泡(EV)结合到阴离子交换粒子的简化的工作流程，然后对结合的EV进行非离液裂解。释放的核酸与用于结合和富集EV的同一种阴离子交换基质的立即再结合节省了工作步骤和材料。此外，可以避免离液盐的使用。取决于所使用的阴离子交换粒子，然后可以使用低盐、中等pH的洗脱缓冲液洗脱结合的细胞外RNA。这种洗脱缓冲液与许多核心下游应用相容，并且不需进一步净化。这同样节省了处理步骤和资源。
[0006]根据本公开，将结合的细胞外囊泡在至少一种去污剂存在下裂解，所述去污剂裂解EV并在酸性裂解条件下允许释放的RNA直接结合到所述阴离子交换粒子。非常有利的是，所使用的去污剂不实质性抑制释放的囊泡RNA与所述阴离子交换粒子的结合。所使用的去污剂可以是非离子或阴离子去污剂。
[0007]为了进一步改进裂解步骤并除去污染蛋白质，在所述裂解步骤中可以包括蛋白水解酶处理，并且可以进行额外的清洗步骤以消除EV组分例如脂质、膜蛋白等。结果，可以消化所有种类的蛋白质，包括可能凭借其净负电荷或通过与存在的其他带负电荷生物分子的相互作用而结合到阴离子交换粒子的蛋白质。
[0008]此外，根据本公开的方法允许使用磁性阴离子交换粒子作为阴离子交换粒子。这避免了使用常用于富集EV的昂贵的现有技术的阴离子交换膜。此外，磁性阴离子交换粒子的使用使得根据本公开的方法可以自动化。因此，根据一个有利实施方式，结合步骤(aa)中的固相由粒子例如磁性粒子提供。这允许以自动或半自动方式执行本专利技术的方法。
[0009]所使用的阴离子交换粒子优选地包含阴离子交换基团，其允许释放的囊泡RNA的高效结合，并在同时允许使用中等的pH高效洗脱结合的RNA。结合的细胞外RNA可以使用高盐，或者优选地使用具有中等pH例如7
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9、例如8至9或8.5至9的低盐缓冲液来洗脱。在此类情况下，富集的细胞外RNA可以直接用于下游应用。
[0010]根据第一方面，提供了一种用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外核酸例如优选为细胞外RNA的方法，所述方法包括下述步骤：
[0011](aa)制备酸性结合混合物，其包含所述样品和阴离子交换固相，并将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换固相；
[0012](bb)从所述结合混合物分离出包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换固相；
[0013](cc)在至少一种去污剂存在下裂解所述结合的细胞外囊泡，并将释放的囊泡核酸例如优选为RNA结合到所述阴离子交换固相；
[0014](dd)从裂解物分离带有结合的核酸的阴离子交换固相。
[0015]正如在本文中公开的，所述细胞外核酸优选为细胞外RNA，其是EV中的主要核酸。此外，尽管可以使用不同形式的固相(包括过滤器和膜)，但在本方法中优选地使用阴离子交换粒子。这是优选的，因为阴离子交换粒子例如磁性粒子易于处理并更好地适合于自动化。因此，本文呈现的公开的焦点在于阴离子交换粒子。尽管专业技术人员将会认识到，本公开也适用于更广泛的情形和其他固相类型的使用。
[0016]根据所述第一方面的方法的一个子方面，提供了一种用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外RNA的方法，所述方法包括下述步骤：
[0017](aa)制备酸性结合混合物，其包含所述样品和阴离子交换粒子，并将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换粒子；
[0018](bb)从所述结合混合物分离出包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换粒子；
[0019](cc)在至少一种去污剂存在下裂解所述结合的细胞外囊泡，并将释放的RNA结合到所述阴离子交换粒子；
[0020](dd)从裂解物分离带有结合的RNA的阴离子交换粒子。
[0021]根据第二方面，提供了一种用于执行根据所述第一方面的方法的试剂盒，其包含：
[0022](a)阴离子交换粒子，
[0023](b)酸性试剂，优选为缓冲液；
[0024](c)酸性裂解试剂，优选为不同于酸性试剂(b)并包含去污剂的缓冲液；
[0025](d)任选的一种或多种清洗溶液；和
[0026](e)任选的一种或多种洗脱溶液。
[0027]术语“试剂”在本文中以广义使用，并且涵盖溶液以及缓冲液的使用。对于本领域技术人员而言，本申请的其他目的、特征、优点和方面将从下文的描述和权利要求书变得显而易见。然而应当理解，下文的描述、权利要求书和具体实例尽管指示了本申请的优选实施方式，但仅以说明的方式给出。
附图说明
[0028]图1A：示出了实施例2的结果，在这里是囊泡mRNA(EEF2)的回收。示出了Ct值，其中更低的Ct值指示更好的回收。
[0029]图1B：示出了实施例2的结果，在这里是囊泡miRNA(let
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7a)的回收。
[0030]图1C：示出了实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外核酸例如优选为细胞外RNA的方法，所述方法包括下述步骤：(aa)制备酸性结合混合物，其包含所述样品和优选地由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相，并将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换固相；(bb)从所述结合混合物分离出包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换固相；(cc)在至少一种去污剂存在下裂解所述结合的细胞外囊泡，并将释放的核酸例如优选为RNA结合到所述阴离子交换固相；(dd)从裂解物分离带有结合的核酸的阴离子交换固相。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：(ee)任选地清洗结合的RNA；和(ff)从优选地由粒子提供的所述阴离子交换固相洗脱所述结合的RNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(cc)包括通过将分离的包含结合的细胞外囊泡的优选由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相与包含至少一种去污剂的酸性裂解试剂进行接触来制备裂解混合物，其中所述去污剂适合于裂解细胞外囊泡，并且其中所述去污剂以使所述结合的细胞外囊泡发生裂解并释放囊泡RNA的浓度用于(cc)的裂解混合物中。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中步骤(cc)包括通过将分离的包含结合的细胞外囊泡的优选由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相与包含所述去污剂的酸性裂解试剂进行接触来制备裂解混合物，其中所述去污剂以0.1至15％例如0.5至10％、0.75％至7％或1％至5％范围内的浓度包含在所述裂解混合物中。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中在步骤(cc)中用于裂解细胞外囊泡的所述至少一种去污剂选自非离子表面活性剂和阴离子去污剂。6.根据权利要求3至5中的任一项所述的方法，其中步骤(cc)的酸性裂解试剂包含：(i)所述至少一种去污剂，其浓度任选地如权利要求4中为所述裂解混合物所定义；和(ii)缓冲剂。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酸性裂解试剂具有促进释放的囊泡RNA与所述粒子的阴离子交换基团结合的酸性pH，并且其中所述酸性裂解试剂具有2.5至5.5例如2.7至5.3、3至5或3至4.7范围内的pH，任选地其中所述pH在3至4.5或3至4.3的范围内。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中在步骤(cc)中使用的所述酸性裂解试剂具有一个或多个下述特征：(i)它包含基于羧酸的缓冲剂，任选为乙酸盐；(ii)它包含浓度≤500mM，例如≤450mM、≤400mM、≤350mM，优选地≤300mM或≤250mM的缓冲剂；(iii)它建立允许释放的囊泡RNA与所述阴离子交换粒子直接结合的条件；(iv)所述酸性裂解试剂中的总盐浓度为1M或更低，优选为0.75M或更低、0.5M或更低或370mM或更低，任选地其中所述酸性裂解试剂中的总盐浓度为300mM或更低或275mM或更低；(v)它不包含离液盐；和/或(vi)它不包含有机溶剂。9.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中步骤(cc)包括添加蛋白水解酶，任
选地其中所述蛋白水解酶是蛋白酶，优选为蛋白酶K。10.根据权利要求3至9中的一项或多项所述的方法，其中在由步骤(cc)中的酸性裂解试剂建立的条件下，从裂解的细胞外囊泡释放的囊泡RNA与所述裂解混合物中存在的阴离子交换粒子结合，并且其中步骤(cc)包括将分离的包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换粒子与所述酸性裂解试剂进行接触，并且其中没有为了在步骤(cc)中建立EV裂解和囊泡RNA结合的条件而添加其他试剂，并且其中在步骤(dd)中从裂解物分离的所述阴离子交换粒子包含与其结合的细胞外RNA，所述细胞外RNA包括囊泡RNA和任选的非囊泡RNA。11.根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中在步骤(aa)中制备的所述酸性结合混合物具有2至6、例如2.5至5.5、优选地3至5、更优选地3至4.5范围内的pH，并且其中准备步骤(aa)中的EV结合条件包括添加酸性试剂，任选地其中所述酸性试剂的pH在2至5、例如2.5至5、优选地3至5、更优选地3至4.5的范围内。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸性试剂包含缓冲剂，优选为基于羧酸的缓冲剂，任选地其中所述基于羧酸的缓冲剂具有一个或多个下述特征：
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所述基于羧酸的缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐，其中优选地所述羧酸(i)包含1至3个羧酸基团，(ii)是脂族的，和/或(iii)是饱和的；
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所述基于羧酸的缓冲剂包含1个羧基；和/或
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所述基于羧酸的缓冲剂是乙酸盐缓冲剂，任选地由乙酸钠/乙酸缓冲剂提供。13.根据权利要求1至12中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(aa)中，用于将细胞外囊泡与阴离子交换粒子结合的所述结合混合物的pH低于所述粒子的阴离子交换基团的离子化形式的pKa，任选地其中所述pH比所述pKa低至少1、至少1.5、至少2或至少2.5个单位。14.根据权利要求1至13中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(aa)中使用磁性阴离子交换粒子作为阴离子交换固相。15.根据权利要求1至14中的一项或多项所述的方法，其中所述阴离子交换粒子具有一个或多个下述特征：(i)它们在粒子表面处包含阴离子交换基团；(ii)它们包含相同或不同类型的阴离子交换基团；(iii)所述阴离子交换基团通过共价附连，任选地使用基于碳二亚胺的反应，特别是通过所述粒子的羧基与所述阴离子交换基团中包含的氨基的反应，附连到所述粒子的表面。16.根据权利要求1至15中的一项或多项所述的方法，其中优选地由粒子提供的所述固相的阴离子交换基团具有一个或多个下述特征：(i)它们包含至少一个可离子化基团作为官能团，其中优选地所述可离子化基团可通过质子化作用离子化，任选地其中所述阴离子交换基团的可离子化基团作为单体、寡聚物或聚合物提供在所述固相的表面上；(ii)它们包含至少一个伯氨、仲氨或叔氨基；和/或(iii)它们包含选自下述结构式的伯胺、仲胺和叔胺的基团(R)3N、(R)2NH、RNH2和/或X
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(CH2)
n
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Y其中
X是(R)2N、RNH或NH2，Y是(R)2N、RNH或NH2，R各自独立地是任选取代的直链、支链或环状烷基、烯基、炔基或芳基取代基，其可以包含一个或多个优选地选自O、N、S和P的杂原子，并且n是0至20、优选地0至18范围内...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：