富集方法技术

本发明专利技术提供了一种用于从包含细胞外DNA和细胞外囊泡的生物样品富集细胞外DNA的方法，其中所述方法包括：(a)制备结合混合物，其包含

Enrichment method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】富集方法


[0001]本专利技术涉及用于从生物样品富集(i)细胞外DNA和/或(ii)细胞外囊泡和/或细胞外RNA的方法。

技术介绍

[0002]来自于无细胞生物流体例如血浆、血清或尿液的细胞外核酸代表了用于诊断和研究的重要分析物。特别相关的是细胞外核酸例如细胞外DNA(在本文中也被称为“无细胞”或“cfDNA”)和细胞外RNA(在本文中也被称为“无细胞”或“cfRNA”)。细胞外RNA存在于例如含有mRNA和miRNA的细胞外囊泡(EV)中。包含在细胞外囊泡中的细胞外RNA也被称为囊泡RNA。此外存在着非囊泡细胞外RNA，其通常与蛋白质结合(例如与Ago2蛋白结合的miRNA)，并因此受到保护免于降解。
[0003]从同一生物样品高效捕获细胞外DNA、EV和/或cfRNA具有挑战性，并且现有技术方法通常使用复杂、耗时的工作流程或昂贵的材料(WO 2012/087241、WO 2017/197399和EP 2941629 B1)。此外，目前可用的方案不允许将cfDNA和cfDNA和/或包含囊泡RNA的cfRNA提供在分开的级分中。
[0004]对用于富集并因此分离(i)细胞外DNA、(ii)包含囊泡RNA的EV和/或细胞外RNA的其他方法存在着越来越多的兴趣和需求。具体来说，对于比现有技术工作流程更加简单并允许将(i)细胞外DNA和(ii)和/或细胞外RNA作为分开的级分提供的改进的方法，存在着需求。此外，对可以自动化的方法存在着需求。
[0005]本公开的目的是提供避免了现有技术缺点的试剂盒和方法。具体来说，目的是证明一种用于富集(i)细胞外DNA和(ii)包含囊泡RNA的EV和/或细胞外RNA的方法和试剂盒。

技术实现思路

[0006]本公开是基于下述发现，即来自于包含细胞外囊泡的生物样品的细胞外DNA，可以在EV和/或cfRNA与包含阴离子交换基团的固相的结合被减弱的条件下结合到所述固相。
[0007]正如实施例所证实的，根据本公开的方法允许通过下述方式从包含细胞外DNA和细胞外囊泡(EV)的生物样品(特别是除细胞体液例如血浆)富集细胞外DNA(也被称为“无细胞DNA”或“cfDNA”)：将细胞外DNA选择性结合到固相(例如磁珠)的阴离子交换表面，并将结合的DNA与剩余的结合混合物分离开。在所述cfDNA结合步骤中，可以通过选择结合条件和所述固相的阴离子交换基团，特别是通过调节所使用的结合缓冲液的酸性pH，来减弱EV与所述固相的结合。正如实施例所证实的，不同的缓冲剂和阴离子交换基团可用于cfDNA的偏好性结合，同时减弱EV或cfRNA(也被称为“无细胞RNA”或“细胞外RNA”)的结合。在实施方式中，在分离出带有结合的cfDNA的固相后，至少50％的EV和cfRNA保留在所述结合混合物中。
[0008]因此，根据本公开的结合条件允许将细胞外DNA选择性捕获到所述阴离子交换表面，同时不将EV(其含有大部分细胞外RNA)以相同的程度捕获到所述阴离子交换表面。由于可以减少RNA污染，这允许提供一种用于分离细胞外DNA的改进的方法。
[0009]此外，这些减弱EV和cfRNA与阴离子交换表面的结合的cfDNA选择性结合条件提供了顺序分离不同靶分析物的机会，例如在第一结合步骤中分离cfDNA，然后在第二结合步骤中富集EV和/或总cfRNA。有利情况下，根据本专利技术使用的cfDNA结合条件不促进EV的破坏。在分离带有结合的cfDNA的固相后，剩余的结合混合物(例如上清液)中包含完整EV和其他分析物例如非囊泡RNA(例如某些miRNA)。因此，所述剩余的结合混合物可用于分离其他分析物例如EV和/或总cfRNA。这允许将cfDNA和囊泡RNA(或包含囊泡RNA的总cfRNA)提供在分开的级分中，便于使用不同类型的测定法对得到的级分(例如洗脱液)分开地进行分析。通过这种方式，本公开还提供了用于顺序富集细胞外DNA和其他靶分析物，例如将ccfDNA和EV(或EV内含物)或cfDNA和总cfRNA顺序富集在分开的洗脱液中的方法。包含在EV中的核酸可以独立于所述细胞外DNA进行分析。这可能是非常有利的，因为常常会对细胞外DNA和细胞外RNA进行不同的分析，例如测试不同类型的变体。例如，DNA可以进行单核苷酸变体(SNV)、插入和缺失(InDel)和拷贝数变体(CNV)的分析，而RNA可以进行融合、外显子跳跃事件和基因表达水平的分析。
[0010]此外，本文公开的不同靶分析物的顺序分离允许进一步研究细胞外核酸。具体来说，也已显示细胞外囊泡含有来自于它们的起源细胞的基因组DNA片段。本公开中描述的方法可用于将此类囊泡DNA与非囊泡无细胞DNA分开，从而允许两者的独立表征。
[0011]此外，根据本公开的方法允许使用磁性阴离子交换粒子作为固相。这避免了使用常用于富集EV的昂贵的现有技术的阴离子交换膜。此外，磁性阴离子交换粒子的使用使得根据本公开的方法可以自动化。因此，根据一个有利实施方式，细胞外DNA结合步骤(a)中的固相由粒子例如磁性粒子提供。这允许以自动或半自动方式执行本专利技术的方法。
[0012]根据第一方面，提供了一种用于从包含细胞外DNA和细胞外囊泡的生物样品富集细胞外DNA的方法，其中所述方法包括：
[0013](a)制备结合混合物，其包含
[0014]‑
所述生物样品，
[0015]‑
包含阴离子交换基团的固相，
[0016]‑
包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
[0017]并将细胞外DNA结合到所述包含阴离子交换基团的固相；
[0018](b)将带有结合的细胞外DNA的固相与剩余的结合混合物分离开，其中所述剩余的结合混合物包含细胞外囊泡。
[0019]所述方法还可以包括处理所述剩余的结合混合物以从中富集一种或多种感兴趣的生物靶，其中处理任选地包括
[0020](c)从所述剩余的结合混合物富集作为生物靶的细胞外囊泡和/或细胞外RNA。
[0021]根据第二方面，提供了一种用于从包含细胞外DNA和细胞外囊泡的生物样品顺序富集(i)细胞外DNA和(ii)细胞外囊泡和/或细胞外RNA的方法，其中所述方法包括：
[0022](a)制备结合混合物，其包含
[0023]‑
所述生物样品，
[0024]‑
包含阴离子交换基团的固相，
[0025]‑
包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，
[0026]并将细胞外DNA结合到所述固相；
[0027](b)将带有结合的细胞外DNA的固相与所述结合混合物分离开，其中剩余的结合混合物包含细胞外囊泡；和
[0028](c)从所述剩余的结合混合物富集细胞外囊泡和/或细胞外RNA。
[0029]根据第三方面，提供了一种用于从包含细胞外囊泡和非靶生物分子的生物样品富集细胞外囊泡和/或细胞外RNA的方法，所述方法包括：
[0030](a)制备结合混合物，其包含
[0031]‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从包含细胞外DNA和细胞外囊泡的生物样品富集细胞外DNA的方法，其中所述方法包括：(a)制备结合混合物，其包含
‑
所述生物样品，
‑
包含阴离子交换基团的固相，
‑
包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，并将细胞外DNA结合到所述包含阴离子交换基团的固相；(b)将带有结合的细胞外DNA的固相与剩余的结合混合物分离开，其中所述剩余的结合混合物包含细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其包括处理所述剩余的结合混合物以从中富集一种或多种感兴趣的生物靶，其中处理包括(c)从所述剩余的结合混合物富集作为生物靶的细胞外囊泡和/或细胞外RNA。3.一种用于从包含细胞外DNA和细胞外囊泡的生物样品顺序富集(i)细胞外DNA和(ii)细胞外囊泡和/或细胞外RNA的方法，其中所述方法包括：(a)制备结合混合物，其包含
‑
所述生物样品，
‑
包含阴离子交换基团的固相，
‑
包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，并将细胞外DNA结合到所述固相；(b)将带有结合的细胞外DNA的固相与所述结合混合物分离开，其中剩余的结合混合物包含细胞外囊泡；和(c)从所述剩余的结合混合物富集细胞外囊泡和/或细胞外RNA。4.一种用于从包含细胞外囊泡和非靶生物分子的生物样品富集细胞外囊泡和/或细胞外RNA的方法，所述方法包括：(a)制备结合混合物，其包含
‑
所述生物样品，
‑
包含阴离子交换基团的固相，
‑
包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，并至少将作为非靶生物分子的细胞外DNA结合到所述固相；(b)将带有结合的细胞外DNA的固相与所述结合混合物分离开，其中剩余的结合混合物包含细胞外囊泡；和(c)从所述剩余的结合混合物富集细胞外囊泡和/或细胞外RNA。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述结合缓冲液的pH在2.5至6.5或3至6.5、优选地3.5至6、3.7至5.5或4至5.2的范围内，任选地其中在步骤(a)中，所述结合混合物的pH对应于所述酸性结合缓冲液的pH，或与所述结合缓冲液的pH偏离≤1.5个pH单位，优选地≤1、≤0.75或≤0.5个pH单位。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述结合混合物的pH在2.5至6.5、特别是3至6.5例如3.5至6、3.7至5.5或4至5.2的范围内，任选地其中在步骤(a)中，所述结合混合物的pH≥4、≥4.2或≥4.5。
7.根据权利要求1至6中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述结合混合物的pH低于所述固相的阴离子交换基团的离子化形式的pKa，任选地其中所述pH比所述pKa低至少1、至少1.5、至少2或至少2.5个单位。8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的酸性结合缓冲液包含基于羧酸的缓冲剂，任选地其中(i)所述缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐，和/或(ii)所述缓冲剂包含选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐和酒石酸盐的缓冲组分。9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(a)的结合缓冲液具有≥3.5、优选地≥3.8或≥4的pH，并且其中所述缓冲剂包含选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、丙酸盐、乳酸盐和酒石酸盐，优选地选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、乳酸盐和酒石酸盐，更优选为柠檬酸盐或草酸盐的缓冲组分。10.根据权利要求1至9中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述结合混合物包含源自于所述结合缓冲液的缓冲剂，其浓度选自(i)0.5M或更低、0.35M或更低、0.3M或更低或优选地0.25M或更低；(ii)至少15mM，例如至少25mM或至少35mM，例如至少40mM，和/或(iii)15mM至250mM、25mM至200mM、30mM至150mM或40mM至125mM的范围。11.根据权利要求1至10中的一项或多项所述的方法，其中所述结合缓冲液包含作为缓冲剂的缓冲盐以及除此之外的非缓冲盐，优选为碱金属盐，其中所述结合缓冲液中的非缓冲盐的浓度为1M或更低，优选为750mM或更低、500mM或更低、370mM或更低、300mM或更低或250mM或更低。12.根据权利要求1至11中的一项或多项所述的方法，其中步骤(a)的酸性结合缓冲液中的总盐浓度为1M或更低、750mM或更低或500mM或更低。13.根据权利要求1至12中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(a)中使用的所述固相由粒子、优选为磁性粒子提供。14.根据权利要求1至13中的一项或多项所述的方法，其中所述固相包含含有至少一个伯氨、仲氨或叔氨基的阴离子交换基团。15.根据权利要求1至14中的一项或多项所述的方法，其中所述固相的阴离子交换基团包含选自下述结构式的伯胺、仲胺和叔胺的基团(R)3N、(R)2NH、RNH2和/或X
‑
(CH2)
n
‑
Y其中X是(R)2N、RNH或NH2，Y是(R)2N、RNH或NH2，R彼此独立地是任选取代的直链、支链或环状烷基、烯基、炔基或芳基取代基，其可以包含一个或多个优选地选自O、N、S和P的杂原子，并且n是0至20、优选地0至18范围内的整数。16.根据权利要求1至15中的一项或多项所述的方法，其中所述阴离子交换基团具有至少一个下述特征：(i)它们包含至少一个氨基，其中所述氨基是杂环或杂芳环的一部分，任选地其中所述氨基是咪唑环的一部分：(ii)它们包含组氨酸或组胺；
(iii)它们包含至少一个可离子化基团，其离子化形式、优选为质子化形式的pKa值在6至约13或7至约12的范围之内；和/或(iv)它们包含
‑
用于cfDNA结合的三烷基胺基和/或二烷基氨基烷基，并且任选地没有其他用于cfDNA结合的可离子化基团，任选地其中所述烷基可以彼此独立地包含1
‑
6、1至5或1至4个碳原子；和/或
‑
硅烷基，任选地其中所述固相包含通过用三烷基硅烷官能化而提供的阴离子交换基团，所述三烷基硅烷任选为N,N
‑
二烷基
‑3‑
(氨基烷基)三烷氧基硅烷，其中所述烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。17.根据权利要求13至16中的任一项所述的方法，其中在步骤(a)中使用的所述固相由磁性粒子提供，并且其中所述磁性粒子的阴离子交换基团包含三烷基胺基，并且其中所述结合缓冲液具有≥3.5、优选地≥3.8或≥4的pH，并且其中所述缓冲剂包含选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、丙酸盐、乳酸盐和酒石酸盐，优选地选自柠檬酸盐、草酸盐、甲酸盐、乳酸盐和酒石酸盐，更优选为柠檬酸盐的缓冲组分。18.根据权利要求1至17中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(b)中分离所述带有结合的细胞外DNA的固相之后，所述方法包括：(i)清洗所述细胞外DNA；和/或(ii)从所述固相回收、优选地洗脱所述细胞外DNA。19.根据权利要求2至18中的一项或多项所述的方法，其中步骤(c)包括从在步骤(b)后收集的所述剩余的结合混合物富集细胞外囊泡(EV)和...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：