用于分离细胞外核酸的快速方法技术

本发明专利技术涉及用于分离细胞外核酸的快速方法。具体地，本发明专利技术涉及一种用于从样品分离细胞外核酸的方法，其中通过将所述细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，任选地使所述样品稳定，所述方法包括下列步骤：在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的第一pH；其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％；分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；任选地清洗所述细胞外核酸；任选地从所述固相洗脱细胞外核酸。所述方法具有可以处理大样品体积并且可以高得率快速分离细胞外核酸的优点。所述方法特别适合于可自动化的过程。方法特别适合于可自动化的过程。方法特别适合于可自动化的过程。

【技术实现步骤摘要】
用于分离细胞外核酸的快速方法
[0001]本申请是国际申请日2012年9月25日、国际申请号PCT/EP2012/068847于2014年5月12日进入中国国家阶段、申请号201280055508.0、专利技术名称“用于分离细胞外核酸的快速方法”的申请的分案申请。
[0002]产生本专利技术的工作接受了欧洲共同体第七框架计划(European Community's Seventh Framework Programme)(FP7/2007
‑
2013)的资助协议号222916下的资助。


[0003]本文所公开的专利技术涉及从样品、尤其是血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清分离细胞外核酸的方法以及相关的技术。

技术介绍

[0004]已在血血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应来说，是尤为令人感兴趣的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别同一性、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，包含细胞外核酸的样品还可能包含未包含在细胞内的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。病毒核酸从样品例如尤其是血液样品或源自于血液的样品的有效分离，对于许多诊断应用来说也是重要的。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿来源或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters 581(2007)795
‑
799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40
‑
49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，Biochmica et Biophysica Acta 1775(2007)191
‑
232，Hromadnikova等，(2006)DNA and Cell biology,Volume 25,Number 11pp 635
‑
640；Fan等，(2010)Clinical Chemistry 56:8。
[0005]因此，为了允许可靠的分析，细胞外核酸的有效分离是极为重要的。然而，细胞外核酸通常仅仅以低浓度包含在样品中。例如，自由循环的核酸以1
‑
100ng/ml血浆的浓度存在于血浆中。此外，细胞外核酸通常作为大小为500nt、300nt(当指示尺寸以及因此链长时，术语“nt”在DNA的情形中也包括“bp”)或甚至更小的片段(循环核小体)循环。此外，出于诊断目的打算鉴定的真正的目标细胞外核酸通常仅占总细胞外核酸的一小部分。例如，肿瘤特异性DNA片段非常稀少，并且通常以比“正常”细胞外核酸背景低1000倍的浓度被包含。因此，希望处理大样品体积以便获得足够量的细胞外核酸，尤其是足够量的包含在其中的稀
有目标分子，以用于下游测定。
[0006]在现有技术中，已知几种用于从样品例如尤其是血浆样品分离细胞外核酸的方法。在这里，几种试剂盒也是可商购的。然而，尽管这些试剂盒提供了有用的结果，但它们也具有需要改进的缺点。
[0007]例如，QIAamp循环核酸试剂盒允许处理高达5ml的样品量，用于分离细胞外核酸。然而，它需要手动核酸提取。自动进行大体积样品的制备是困难的，这是由于所使用的化学试剂(裂解和结合缓冲液)造成相应的试剂盒需要操控高达25ml的总处理体积。然而，标准的机器人系统仅处理最大3ml的体积。此外，相应的试剂盒还需要几个方法步骤。因此，不但允许处理大样品体积而且同时允许自动进行分离过程的方法，将是有利的。旨在从无细胞样品例如血浆分离例如病毒核酸的其他可商购试剂盒，只能处理相当小的样品体积(参见例如EasyPlex
TM
病毒试剂盒)。在这里，较大样品体积的处理将是有利的，因为这将允许提高核酸得率。
[0008]因此，现有技术方法具有几个缺点。为了克服现有技术的缺点，希望提供用于从大样品体积分离细胞外核酸的方法。这将确保分离到足够的细胞外核酸用于下游应用。如果这种要求得不到满足，则存在着例如即使灵敏的方法也不能检测到被分离的细胞外核酸群体中包含的目标分子的风险。此外，现有技术方法通常是耗时的，因此需要几个操作步骤并因此需要在手上花费的时间。在这里，希望提供仅需要几个步骤来分离细胞外核酸的简单快速的方法。这也将减少在制备期间由操作中的错误造成的潜在错误。此外，希望提供适合于自动化的方法。一旦为常规测试建立起诊断靶之后，顾客例如在实验室中需要自动化来管理更高的通量。自动化分离流程在诊断领域中将具有显著优势，因为它降低由手动核酸分离期间发生的错误造成的错误结果的风险。然而，被设计用于执行这样的自动化核酸分离过程的机器人，受到它们可以操作的最大样品体积的限制(参见上文)。因此，通过添加执行分离过程所必需的试剂而增加样品体积，直接减少了可以处理的样品的量，并因此减少了可以通过自动化分离过程的单次运行而获得的核酸的量。最后，现有技术的试剂盒通常需要用于裂解样品的步骤。需要在现有技术中通常进行的相应的裂解步骤不仅仅是为了例如从细胞释放出核酸。当从所谓的无细胞样品例如血浆分离核酸时，通常也进行相应的裂解步骤，以便变性和/或消化蛋白质污染物或可能干扰例如核酸与固相的结合和/或可能导致不适当的纯化的其他污染物质。为了进行相应的裂解步骤，通常添加大体积的裂解试剂例如离液序列高的试剂。执行相应的增加体积的裂解步骤的必要性是一种缺点，因此这减小了可以在例如自动化系统中处理的真正样品的体积。
[0009]US 2005/0106602描述了从细胞材料样品分离核酸的方法。没有急性化学裂解。相反，使用了核酸结合基团，其用于双重目的，即结合核酸和支持细胞的裂解。WO2006/036243描述了类似的方法。
[0010]Melkonyan等的《跨肾核酸：从原理验证到临床试验》(Transrenal nucleic acids:"From proof of principle to clinical tests",2008)描述了从尿液分离细胞外核酸。将样品与Q
‑
Sepharose阴离子交换基质相接触以结合核酸，随后对其进行清洗和洗脱。所使用的分离流程的详细情况描述在Shekhtman等，“跨肾DNA分析的优化：母体尿液中胎儿DNA的检测”(Opti本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相以从样品分离所述细胞外核酸的方法，所述方法包括下列步骤：a.在允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的第一pH下，将所述细胞外核酸结合于所述固相，b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；c.任选地清洗所述细胞外核酸；d.任选地从所述固相洗脱细胞外核酸。2.权利要求1的方法，其包含下列步骤：a.在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的第一pH；其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％；b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；c.任选地清洗所述细胞外核酸；d.任选地从所述固相洗脱细胞外核酸。3.权利要求1或2的方法，其包含下列步骤：a.酸化所述样品以建立结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6.5的第一pH，其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％，并且其中所述固相由磁性粒子提供；b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；c.任选地清洗所述细胞外核酸；d.从所述固相洗脱细胞外核酸。4.权利要求2或3的方法，其包含下列步骤：a.酸化所述样品以建立所述结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6.5的第一pH，其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％，并且其中所述固相由带有叔氨基、优选为二烷基氨基、更优选为二乙基氨基丙基的磁性粒子提供；b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；c.任选地清洗所述细胞外核酸；d.从所述固相洗脱细胞外核酸，其中被洗脱的核酸的长度和保持结合于所述阴离子交换基质的核酸的长度通过调整洗脱条件来控制，其中长度为约1000nt或更长、优选地700nt或更长、更优选地500nt或更长的核酸在所述洗脱步骤中绝大多数保持结合于所述固相。5.权利要求3或4的方法，其中在步骤d.中，通过调整所述固相表面上正电荷的浓度，使得在步骤d.期间只有较长的核酸分子保持结合于所述固相，而较小的核酸被洗脱，来实现短核酸的选择性洗脱，其中截止值通过选择在洗脱期间使用的pH值来控制。6.权利要求1至5的一项或多项的方法，其中在步骤d.中，细胞外核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，其中所述尺寸分级洗脱步骤包括在高于所述第一pH的第二pH下洗脱一部分结合于所述固相的细胞外核酸，其中在这一步骤中从所述固相洗脱的核酸的平均长度短于保持结合于所述固相的核酸的平均长度。
7.权利要求2至6的一项或多项的方法，其通过将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，用于从贫细胞或无细胞样品、优选为血浆或血清分离所述细胞外核酸，其中所述固相由优选地带有叔胺、优选地包含二乙基氨基丙基的磁性粒子提供，所述方法包括下列步骤：a.酸化所述样品以建立所述结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6的第一pH，其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％；b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；c.任选地清洗所述细胞外核酸；d.从所述固相洗脱细胞外核酸，其中在步骤d.中，细胞外核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，其中所述尺寸分级洗脱步骤包括在高于所述第一pH并≥8的第二pH下洗脱一部分结合于所述固相的细胞外核酸，其中在这一步骤中从所述固相洗脱的核酸的平均长度短于保持结合于所述固相的核酸的平均长度，并且其中长度为约1000nt或更长、优选地700nt或更长、更优选地500nt或更长的核酸在所述洗脱步骤中绝大多数保持结合于所述固相。8.权利要求1至7的一项或多项的方法，其中执行洗脱步骤d)以及其中在步骤d)中，所述核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，其中截止值由在所述洗脱期间使用的pH值和/或盐浓度来控制。9.权利要求1至8的一项或多项的方法，其中将所述样品分拆，将所述样品部分平行地进行处理，并将洗脱液或洗脱之前的阴离子交换材料重新合并。10.权利要求1至9的一项或多项、尤其是权利要求2的方法，其中所述结合混合物通过将所述样品的pH调整到所述第一pH来制备。11.权利要求1至10的一项或多项、尤其是权利要求2和10的方法，其中步骤a)具有一个或多个下述特征：i)所述第一pH低于所述固相的阴离子交换基团的可质子化基团的pKa值；ii)向所述样品加入至少一种酸化试剂和/或化合物，优选为酸性溶液，以调整所述第一pH；iii)所述第一pH≤6.5，优选地≤6；iv)所述第一pH在选自4至6.5、4.5至6.5、5至6.5和5至6的范围内；和/或v)所述样品占所述结合混合物体积的至少90％、至少95％或至少97％。12.权利要求1至11的一项或多项、尤其是权利要求2和权利要求10和11的方法，其中所述样品具有一个或多个下述特征：a)它是无细胞、贫细胞或含细胞的样品；b)它选自全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、液剂、脑脊液、腹水、乳液、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、体液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物以及源自于上述样品的样品，尤其是从上述样品通过移除细胞而产生的无...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：