一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法技术

本发明专利技术采用一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法对两个或者两个以上位点变化（如SNP，突变等）的PCR产物（多个DNA模板）进行单体型分析，PCR产物被特定测序引物杂交后分成两份，各自加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸，然后对未封闭的引物继续合成测序，得到特定DNA模板的序列信息,从而确定PCR产物的单体型。

【技术实现步骤摘要】
一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种采用引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法。
技术介绍
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。在基础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过DNA序列信息的分析可以为理解生命的起源、疾病发生、以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。人的基因组中存在诸多的基因变异引起的疾病，如目前已经确定4000多种遗传疾病是由单碱基突变引起的，而一些重大疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑郁症、哮喘等，是受众多基因相关。然而基因型的信息本身是一种低外显度遗传变异，加上病例-对照研究方法的局限性，可能会出现假阴性和假阳性结果；另外,在预测功能性SNP时,主要集中在可能引起蛋白质中氨基酸改变和影响转录调节区活性的位点上,这样势必漏掉一些其他重要的功能位点,。已有的研究发现,位于同一条染色体上的不同位点基因型之间不是孤立的，相邻的等位基因往往倾向于同时出现。如果相邻的等位基因同时出现的频率超过了随机发生的概率时,称为连锁不平衡，处于连锁不平衡的、相邻的SNP等位位点也倾向于以一个整体遗传给后代。位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的基因型的组合叫作单体型，单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量。目前普遍采用间接的方法则是利用多个基因型的分型结果，以统计方法推断单体型，这种方法得到广泛了的应用，且用于构建单体型的相关软件也非常之多。然而，软件分析的结果对于临床样本而言，如果得不到直接的实验证实终究是不踏实的，临床检测也很难接受这样的分析结果。通过实验方法得到自然状态下真实的单体型情况需要进行单分子测序(如克隆测序、高通量测序等)，这些方法由于成本高，不适于大规模的个体样本分析。对于常规PCR产物中包含多个SNP位点的实验分析单体型方法，均采用一种等位基因特异引物-PCR(AS-PCR)的方法，以第一个SNP位点为扩增起始点，用两种特异引物将起始为两种的不同DNA模板分别进行扩增，然后分别进行测序，以确定其它SNP位点的碱基信息。然而，这种方法由于需要等位基因的特异扩增引物，因而扩增引物的优化设计受到限制，其扩增效率会因不同的扩增片段而不相同，甚至无法扩增出目的片段，操作繁琐、效率不高；同时需要标记两个特异扩增引物，费用也不低廉。现有AS-PCR方法分析单体型是将不同的DNA模板分别扩增，然后进行序列分析来实现的。如果能将不同DNA模板同时进行PCR扩增，但分别进行测序，同样可以达到单体型分析的目的，且扩增引物可以优化设计，适合所有两相邻基因型位点间的序列分析。基于上述原理，本专利技术提出一种PCR产物的单体型分析方法，该方法可以设计优化PCR引物扩增需要分析的核酸序列片段，然后进行序列分析，适合任意两（多）位点间的单体型分析，操作相对简便，价格低廉，可以用于临床检测。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是：提供一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，当待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板时，沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型方法，针对待检样本中一段核酸序列中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板，可沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型，具体步骤为：步骤1）扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行扩增；步骤2）DNA单链制备：将PCR产物利用5’端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结合，并通过变性将未固定的PCR另一条DNA链清除，获取固定的单链DNA模板；步骤3）测序引物的杂交：根据检测位点所包含的可能信息，在PCR单链DNA模板的第一个分析位点前，杂交完全互补的测序引物；步骤4）测序引物的封闭：根据检测位点所包含的可能信息，加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸；步骤5）测序引物的延伸测序：当测序引物被部分封闭后，未封闭的测序引物采用现有技术延伸，实现对DNA模板序列的测定；步骤6）DNA模板单体型的确定：根据步骤5）测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得到碱基信息，构建DNA单体型。上述的一种PCR产物的单体型分析方法中，序列变化位点包括SNP、突变、插入或缺失等造成的碱基序列发生变化。上述的一种PCR产物的单体型分析方法中，PCR引物5’端修饰的活性基团是在热条件下稳定的丙烯酰胺、生物素或氨基，所述载体为丙烯酰胺、表面修饰亲和素或醛基或羧基基团的载体，使得PCR引物5’端修饰的活性基团能够与载体、或者载体表面基团发生化学反应而固定到载体上。上述的一种PCR产物的单体型分析方法中，3’端羟基封闭的单体试剂包括ddNTPs，3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基等修饰的核苷酸；合成测序包括包括单核苷酸加入焦磷酸测序、两核苷酸加入焦磷酸测序，桑格测序技术，在焦磷酸测序方法测定分析序列时，测序引物经封闭反应后，其测序反应体系可以直接用于测序反应；而在使用桑格技术测序时，应先将测序引物经过封闭反应后的反应液清除，配制桑格测序反应液、使测序引物延伸，延伸单链产物用于电泳测序分析。采用一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法来分析MMP7(U25346)基因PCR产物，该PCR产物包含A/G(rs11568818)和C/T(rs11568819)核酸片段的单体型，具体步骤为：(1)将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板，PCR扩增引物为SEQIDNO:1，即5’-AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3’和SEQIDNO:2，即5’-biotin-CTATGAGAGCAGTCATTTGACTTTG-3’；(2)将PCR扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应，使修饰生物素的DNA链固定到磁珠上，在0.2MNaOH溶液下变性，将未固定的另一条DNA链清除，然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板，分成两份用于下列实验；(3)将测序引物SEQIDNO:3，即：5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’与磁珠固定的其中一份单链DNA模板进行杂交；(4)在焦磷酸测序反应体系中加入ddATP使测序引物完成一个碱基延伸；(5)将上述（4）的反应体系置于焦磷酸测序仪（PSQ96MAsystem(BiotageAB,Uppsala,Sweden)）中，按照指定的单个核苷酸加入顺序对未封闭测序引物杂交的DNA模板进行序列测定。(6)按照(3),(4),(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于：一段核酸序列的待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板，沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型，具体步骤为：步骤一扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行扩增；步骤二DNA单链制备：将PCR产物利用5’端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结合，并通过变性将未固定的PCR另一条DNA链清除，获取固定的单链DNA模板；步骤三测序引物的杂交：根据检测位点所包含的可能信息，在PCR单链DNA模板的第一个分析位点前，杂交完全互补的测序引物；步骤四测序引物的封闭：根据检测位点所包含的可能信息，加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸；步骤五测序引物的延伸测序：当测序引物被部分封闭后，未封闭的测序引物采用现有技术延伸，实现对DNA模板序列的测定；步骤六DNA模板单体型的确定：根据步骤5）测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得到碱基信息，构建DNA单体型。...

【技术特征摘要】
1.一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于：一段核酸序列的待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板，沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型，具体步骤为：步骤一扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行扩增；步骤二DNA单链制备：将PCR产物利用5’端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结合，并通过变性将未固定的PCR另一条DNA链清除，获取固定的单链DNA模板；步骤三测序引物的杂交：根据检测位点所包含的可能信息，在PCR单链DNA模板的第一个分析位点前，杂交完全互补的测序引物；步骤四测序引物的封闭：根据检测位点所包含的可能信息，加入一种3’端封闭的单体试剂，即ddNTPs或3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基修饰的核苷酸之一，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸；步骤五测序引物的延伸测序：当测序引物被部分封闭后，未封闭的测序引物采用现有技术延伸，实现对DNA模板序列的测定；步骤六DNA模板单体型的确定：根据步骤五测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得到碱基信息，构建DNA单体型。2.根据权利要求1所述的一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于序列变化位点包括SNP、突变、插入或缺失造成的碱基序列发生变化。3.根据权利要求1所述的一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于所述PCR引物5’端修饰的活性基团为在热条件下稳定的丙烯酰胺、生物素或氨基之一，所述载体为丙烯酰胺、表面修饰亲和素或醛基或羧基基团的载体之一，使得PCR引物5’端修饰的活性基团能够与载体、或者载体表面基团发生化学反应而固定到载体上。4.根据权利要求1所述的一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，潘荣芳，浦丹，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32