本发明专利技术公开一种用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法，用于制备shRNA的引物包括引物P1、P2、P3；P1长度为34nt，从5’端开始，依次为突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及与siRNA正向序列3’末端3个碱基反向互补的碱基；P2，5’端4个碱基由ACCG改变为AAAA，其余序列与P1相同；P3是siRNA正向序列5’末端18nt序列的反向互补序列。三条引物长度均不超过35nt，可有效避免长引物合成过程中发生的碱基错误，提高了shRNA的保真性，成本低，适用于高通量制备shRNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于制备shRNA的引物及制备方法、载 体及构建方法。
技术介绍
RNA干扰（RNA interference，RNAi)是一种普遍存在于生物体内、序列特异性强、 转录后水平的基因沉默机制。目前，采用RNAi技术快速实现生物体内基因沉默已经成为动 植物基因功能研究中一种有力的实验工具。 由于动植物体内各自的特点及其RNAi作用机制的差异，当今用于动植物基因功 能研究的RNAi的作用分子也有所不同。目前，应用较为普遍的发挥干扰作用的小RNA分 子在动物体内主要有siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)以 amiRNA (artificial microRNA)等。而植物体内主要有 hpRNA (hairpin RNA)和 amiRNA。最 早采用RNAi技术研究生物体内基因功能的方法是将体外制备好单链siRNA分子直接注入 线虫体内，虽然后来在动植物的基因功能研究中被沿用，但是这种方法的干扰时效性相对 较短，为达到有效干扰而提高siRNA浓度又往往有细胞毒性。现在的RNAi技术采用的方法 多为构建一个特定的RNAi表达载体，该载体导入动植物细胞后能由RNA聚合酶II型或III 型启动子转录出相应的shRNA、amiRNA以及hpRNA (hairpin RNA)等，进而干扰与其靶基因 的表达（Plant Cell. 2006. May ;18 (5) :1121-33.)。 目前，普遍用于构建ShRNA干扰表达载体的方法主要有以下两种：（I)寡核苷酸退 火法，普遍做法是化学合成两条特定的寡核苷酸引物，在离体条件下退火形成两端带有黏 性末端的双链shRNA片段，然后与经过酶切处理同样带有黏性末端的载体连接转化，得到 含有shRNA干扰表达单元的重组质粒。（II)PCR扩增法：设计一对扩增控制shRNA表达启 动子的PCR引物，其中正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5'末端额外加上针对目的 基因的干扰靶序列，将PCR产物克隆到相应的载体上，得到shRNA干扰表达载体（Physiol Genomics. 2007Novl4 ；31(3) ：554-62.)〇 以上两种方法虽然都能构建各种RNA干扰表达载体，但也存在不足之处，主要表 现在以下几个方面： -、引物设计过长，容易产生突变，克隆效率低。方法（I)中使用的寡核苷酸单链 通常为60-100nt，合成这种长度的寡核苷酸单链不仅合成费用大幅提高，而且碱基合成过 程中的错误率也会明显增加，进而增加了重组质粒筛选的工作量，费时费力。二、操作繁琐， 不适合高通量构建RNA干扰载体。 以上两类制备shRNA序列的方法，对于构建单个或少数RNA干扰载体虽然可行，但 是对于大批量构建RNA干扰载体来讲，工作量大，操作繁琐，效率低下。方法（II)需要在 PCR引物中加上针对靶基因的干扰序列，通常需要长引物（通常大于70nt)或者多轮的PCR 扩增反应，扩增后的PCR产物也需要经过复杂的双酶切、回收等步骤，因外源片段一般都较 小（200bp以内），回收纯化效率较低，而且载体与非目的片段连接或自连的几率很高，使后 续的筛选鉴定过程复杂化，致使工作量增加。 因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于制备shRNA的引物及 制备方法、载体及构建方法，本专利技术所提供的shRNA制备方法可快速、高效、低成本、高通量 制备高保真性shRNA，尤其适合于大规模地构建动植物RNA干扰（RNA interference，RNAi) 表达载体，用于动植物基因的功能研究，旨在解决现有技术中引物设计过长、克隆效率低、 操作繁琐等问题。一种用于制备ShRNA的引物，其中，包括三条引物P1、P2、P3;引物P1长度为34nt， 从5'端开始，依次为突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及与 siRNA正向序列3'末端3个碱基反向互补的碱基；引物P2,5'端4个碱基由ACCG改变为 AAAA，其余序列与P1相同；引物P3是siRNA正向序列5'末端18nt序列的反向互补序列； 其中，loop 序列为 CTCGAG 或 ITCAAGAGA。 一种shRNA的制备方法，其中，采用如上所述的三条引物退火合成双链shRNA，包 括以下步骤： 针对目的基因设计和合成引物后，将引物Pl、P2和P3分别稀释为10 iiM的浓度 后，以1:1:2的比例混合，再加入占总体积1/10的1M NaCl进行退火； 将上述混合充分的试剂置于已停止加热的沸水中，然后待其自然降至室温。 -种shRNA的表达载体，其中，所述表达载体为慢病毒干扰载体，其中包含shRNA 表达框、绿色荧光蛋白表达框；所述shRNA表达框包含shRNA表达启动子，采用如上所述的 shRNA的制备方法制备得到的shRNA，以及致死基因ccdB ;所述绿色荧光蛋白表达框包含 EFla启动子和copGFP绿色荧光蛋白表达基因； 所述shRNA表达启动子为启动子U6、H1或7SK之一。 一种如上所述的shRNA的表达载体的制备方法，其中，包括以下步骤： 制备载体骨架； 在载体骨架上插入shRNA表达启动子； 在载体骨架上插入ccdB序列； 在载体骨架上插入如权利要求2所述的shRNA的制备方法制备得到的shRNA。 所述的shRNA的表达载体的制备方法，其中，制备载体骨架的过程如下： 以 pCDFl-MCS2-EFl_copGFP 载体为模板，PCR 扩增得到 EFla-copGFP 片段，用 Mlul 和Afel双酶切PCR产物，然后插入到同样经过Mlul和Afel双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro 上，得到载体骨架 pLVX-EFla-copGFP-PGK-Puro ; 其中，用于扩增 EFla-copGFP 的寡核苷酸引物为 EFla-copGFP-F :5'-CGACGCGTCGA AGGATCTGCGATCGCTCCG-3' ；EFla-copGFP-R :5' -AGCGCTTTAGCGAGATCCGGTGGAGCCGG-3'。 所述的shRNA的表达载体的制备方法，其中，插入shRNA表达启动子的过程如下： 用Clal和Xhol双酶切载体pLVX-EFla-copGFP-PGK-Puro,去磷酸后电泳回收；扩 增shRNA表达启动子的PCR产物，用Clal和Xhol双酶切扩增产物；将shRNA表达启动子 连接到pLVX-EFla-copGFP-Puro线性载体的相应位点上，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂 LB平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为pLVX-hU6/Hl/7SK-EFla-copGFP-PGK-Puro。 所述的shRNA的表达载体的制备方法，其中，插入ccdB序列的过程如下： 以pLenti6载体为模板，扩增出含有大肠杆菌ccdB致死基因的片段，将扩增的到 的ccdB基因片段用Xhol和Mlu I双酶切后，与经过Xhol和Mlu I双酶切的pLVX-hU6/ Hl/7SK-EFla-copGFP-PGK-Puro线性载本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备shRNA的引物，其特征在于，包括三条引物P1、P2、P3；引物P1长度为34nt，从5’端开始，依次为突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及与siRNA正向序列3’末端3个碱基反向互补的碱基；引物P2，5’端4个碱基由ACCG改变为AAAA，其余序列与P1相同；引物P3是siRNA正向序列5’末端18nt序列的反向互补序列；其中，loop序列为CTCGAG或TTCAAGAGA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苟德明，康康，李洁璇，黄炼，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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