肿瘤靶向药物相关基因突变高通量检测方法、引物及试剂技术

本申请涉及肿瘤基因领域，公开了肿瘤靶向药物相关基因突变高通量测序检测的方法、一组引物对、试剂及试剂盒。本发明专利技术的方法用于检测受体内肿瘤靶向药物相关基因突变的检测，关联基因包括：BRAF，EGFR，KRAS，NRAS，TP53，FGFR3，KIT，PIK3CA，RET，PTEN，CTNNB1。方法包括样品DNA提取、目的基因富集、引物序列去除、接头连接、PCR扩增、文库均一化、文库检测和高通量测序等。通过以本申请公开的引物对肿瘤靶向药物相关基因进行多重PCR富集扩增，用本申请公开的方法，可对上述11个基因中115个突变位点进行检测，检测结果可为肿瘤靶向药物提供用药指导，并为肿瘤新药开发提供依据。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及肿瘤基因领域，尤其涉及一种肿瘤靶向药物相关基因的检测方法、一组引物对、一种试剂和试剂盒。
技术介绍
肿瘤是当今威胁人类健康的最大疾病，在中国肿瘤已经超过冠心病、脑中风，成为第一位死因。传统的化疗治疗，杀灭肿瘤细胞的同时，也对患者的机体造成极大的伤害。随着分子生物学与细胞生物学的发展，对肿瘤的发生发展机理的了解，分子靶向药物治疗成为了肿瘤治疗的有效措施。靶向药物针对肿瘤特异性位点，通过在局部维持较高的浓度，提高针对肿瘤的特异性杀伤力，对正常组织细胞作用较小，避免了化疗治疗的副作用。靶向药物与肿瘤基因突变存在关联性，在选用靶向药物治疗之前，需要确认肿瘤的基因突变位点，用来指导、选择靶向药物，以及预知药物是否有效。目前传统的肿瘤靶向药物相关突变基因检测方法有桑格测序法，荧光定量PCR法，Fish法，microarray等。传统的基因突变检测方法因技术单次只能检测较少的突变位点，灵敏度低，而引起肿瘤发生的基因突变众多，远多过目前传统方法单次能够检测的能力。因此有必要设计针对肿瘤靶向药物有效性的高通量高灵敏度的检测方法。
技术实现思路
针对上述现状，本申请的目的在于提供一种基于二测测序技术的肿瘤靶向药物相关基因突变高通量检测方法，一组特异性扩增肿瘤靶向药物相关基因的引物对，一种试剂和试剂盒。为实现上述目的，本申请提供了一种肿瘤靶向药物相关基因的高通量检测方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的突变情况，所述肿瘤靶向药物相关联基因包括BRAF，EGFR，KRAS，NRAS，TP53，FGFR3，KIT，PIK3CA，RET，CTNNB1，PTEN11个基因120个肿瘤药物相关基因突变位点中的至少一种。进一步的，上述受体内肿瘤靶向药物相关基因的基因突变情况包括检测受体内以下11个基因120个突变位点中至少一组突变位点的突变情况：1)BRAF基因第600号密码子；2)BRAF基因第597号密码子；3)BRAF基因第596号密码子；4)BRAF基因第594号密码子；5)BRAF基因第469号密码子；6)BRAF基因第466号密码子；7)CTNNB1基因第37号密码子；8)CTNNB1基因第45号密码子；9)EGFR基因第719号密码子；10)EGFR基因第747号密码子；11)EGFR基因第790号密码子；12)EGFR基因第854号密码子；13)EGFR基因第858号密码子；14)EGFR基因第861号密码子；15)FGFR3基因第248号密码子；16)FGFR3基因第249号密码子；17)FGFR3基因第380号密码子；18)FGFR3基因第391号密码子；19)FGFR3基因第641号密码子；20)FGFR3基因第650号密码子；21)KIT基因第557号密码子；22)KIT基因第559号密码子；23)KIT基因第576号密码子；24)KIT基因第642号密码子；25)KIT基因第816号密码子；26)KRAS基因第146号密码子；27)KRAS基因第117号密码子；28)KRAS基因第61号密码子；29)KRAS基因第13号密码子；30)KRAS基因第12号密码子；31)NRAS基因第146号密码子；32)NRAS基因第117号密码子；33)NRAS基因第61号密码子；34)NRAS基因第13号密码子；35)NRAS基因第12号密码子；36)PIK3CA基因第542号密码子；37)PIK3CA基因第545号密码子；38)PIK3CA基因第546号密码子；39)PIK3CA基因第549号密码子；40)PIK3CA基因第1047号密码子；41)PTEN基因第159号密码子；42)PTEN基因第233号密码子；43)PTEN基因第267号密码子；44)RET基因第918号密码子；45)TP53基因第306号密码子；46)TP53基因第273号密码子；47)TP53基因第248号密码子；48)TP53基因第245号密码子；49)TP53基因第175号密码子。本申请中检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况是采用特异性引物多重PCR扩增及测序步骤的方法进行。进一步的，在所述测序步骤后，包括分析测序结果，即根据所述测序结果选择肿瘤靶向药物，判断靶向的有效性。具体的上述特异性引物多重PCR扩增及测序检测方法包括以下步骤：1)样品DNA提取。2)目的基因多重PCR扩增：将样品DNA与多重PCR扩增试剂混合，同时加入一组引物对，进行PCR扩增，得到79～190bp长度的目的基因DNA片段。3)引物酶解：将步骤3所的到的PCR扩增DNA片段，加入引物特异性酶解试剂，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到不同长度的DNA片段。4)接头连接：将步骤3所得到的DNA片段与接头、特异性标签、连接反应试剂、End-repair反应后纯化，得到加了接头的DNA片段。5)PCR扩增：将步骤4获得的DNA片段加入文库扩增试剂，进行PCR扩增，得到小片段DNA文库。6)文库均一化：将步骤5获得的小片段文库加入额定吸附能力的磁珠，进行纯化，获得特定浓度的小片段DNA文库。7)文库检测：将步骤6获得的DNA文库采用AgilientBioanalyzer2100检测文库浓度及文库片段大小。8)高通量测序：对步骤7所得到的文库进行高通量测序，采用IonTorrent或者IonProtonTM测序平台。进一步的，所述突变位点1-49各自对应的多重PCR扩增的引物对依次为：1-6，引物对17，18，引物序列如表1所述；7-8，引物对4，引物序列如表1所述；9-14，引物对13，14，15，16，引物序列如表1所述；15-20，引物对7，8，9，引物序列如表1所述；21-25，引物对10，11，12，引物序列如表1所述；26-30，引物对23，24，25，引物序列如表1所述；31-35，引物对1，2，3，引物序列如表1所述；36-40，引物对5，6，引物序列如表1所述；41-43，引物对20，21，22，引物序列如表1所述；44，引物对19，引物序列如表1所述；45-49，引物对26，27，28引物序列如表1所述。表1：多重PCR扩增的引物对引物对上游引物下游引物1ca本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤靶向药物相关基因突变检测的方法，包括以下步骤：1)样品DNA提取；2)目的基因多重PCR扩增：将样品DNA与多重PCR扩增试剂混合，同时加入一组引物对，进行PCR扩增，得到79‑190bp长度的目的基因DNA片段；3)引物酶解：将步骤3所的到的PCR扩增DNA片段，加入引物特异性酶解试剂，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到肿瘤基因DNA片段；4)接头连接：将步骤3所得到的DNA片段与接头、特异性标签、连接反应试剂、End‑repair反应后纯化，得到加了接头的DNA片段；5)PCR扩增：将步骤4获得的DNA片段加入文库扩增试剂，进行PCR扩增，得到小片段DNA文库；6)文库均一化：将步骤5获得的小片段文库加入额定吸附能力的磁珠，进行纯化，获得特定浓度的小片段DNA文库；7)文库检测：将步骤6获得的DNA文库采用荧光定量PCR的方法检测浓度；8)高通量测序：对步骤7所得到的文库进行高通量测序，采用Ion Torrent或者Ion ProtonTM测序平台。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤靶向药物相关基因突变检测的方法，包括以下步骤：
1)样品DNA提取；
2)目的基因多重PCR扩增：将样品DNA与多重PCR扩增试剂混合，同时加入一组引物对，
进行PCR扩增，得到79-190bp长度的目的基因DNA片段；
3)引物酶解：将步骤3所的到的PCR扩增DNA片段，加入引物特异性酶解试剂，降解去
除PCR扩增片段中的引物序列，得到肿瘤基因DNA片段；
4)接头连接：将步骤3所得到的DNA片段与接头、特异性标签、连接反应试剂、End-repair
反应后纯化，得到加了接头的DNA片段；
5)PCR扩增：将步骤4获得的DNA片段加入文库扩增试剂，进行PCR扩增，得到小片段
DNA文库；
6)文库均一化：将步骤5获得的小片段文库加入额定吸附能力的磁珠，进行纯化，获得特
定浓度的小片段DNA文库；
7)文库检测：将步骤6获得的DNA文库采用荧光定量PCR的方法检测浓度；
8)高通量测序：对步骤7所得到的文库进行高通量测序，采用IonTorrent或者IonProtonTM测序平台。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1采用试剂盒提取DNA，DNA提取试剂盒可采用
Promega公司的Maxwell16FFPEPlusLEVDNAPurificationKit(产品号为AS1135)，也可
使用Qiagen公司的QIAmpDNAFFPETissueKit(产品号为56404)，也可使用Invittrogen
公司的MagMAXTMFFPEDNAIsolationKit。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2采用LifeTechnologies公司的5XIonAmpliSeq
HiFiMasterMix。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3用来酶解引物序列采用Lifetechnologies公司的
Fupareagent(步骤1，2，3，4，5)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4采用Lifetechnologies公司的DNAligase与Ion
AmpliSeqAdapters。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤5采用Lifetechnologies公司的PlatinumPCR
SuperMixHiFi与LibraryAmplificationPrimerKit。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6采用Lifetechnologies公司的IonLibrary
EqualizerTM。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2采用的Primer序列对应的肿瘤靶向药物关联基

\t因包括的：BRAF，EGFR，KRAS，NRAS，TP53，FGFR3，KIT，PIK3CA，RET，PTEN，
CTNNB1；优选的，所述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况检测受体内以
下49中至少一类...

【专利技术属性】
技术研发人员：张煜，
申请(专利权)人：张煜，
类型：发明
国别省市：吉林;22