用于长片段阅读测序的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及用于长片段阅读测序的方法和组合物。本发明专利技术涵盖用于制备基因组DNA的长片段、用于为长片段阅读测序方法加工基因组DNA的方法和组合物及用于加工并分析序列数据的软件和算法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的交叉引用本申请要求2009年6月15日提交的美国专利申请No 61/187,162的优先权权益，在此通过提及而将其完整收录。专利技术背景大规模基因组序列分析是有助理解多种生物现象的一个关键步骤。对低费用、高通量的测序和再测序的需求导致了新的测序方法的开发，这些方法采用了同时对多个核酸目标物的平行分析。常规的测序方法通常局限于在信号明显降解之前可以确定几十个核苷酸，因此整个测序效率受到很大的限制。常规测序方法还经常受限于信噪比，使得这类方法不适合用于单分子测序。如果可以设计出能够提高测序反应效率以及由较短阅读长度组装成完整序列的效率的方法和组合物，整个领域将获益良多。专利技术概述因而，本专利技术提供了测序反应方法和组合物。在一个例示性的实施方案中，本专利技术提供了一种将双链靶核酸片段化的方法。此方法包括(a)提供基因组DNA；(b)将DNA分成许多分开的等分试样(aliquot)；(c)在存在包含dNTP类似物的dNTP群的情况中扩增所述分开的等分试样中的所述DNA，使得DNA中的许多核苷酸被dNTP类似物替换；(d)除去dNTP类似物以形成有缺口的DNA，(e)处理有缺口的DNA以平移所述缺口，直至相反链上的缺口会聚，由此创建平端DNA片段。在又一个实施方案中，分开的混合物中的基本上每个片段与相同等分试样的间隔(every other)片段不重叠。在又一个实施方案中及依照上述任何内容，本专利技术提供了一种用于使核酸片段化的方法，其包括下列步骤：(a)为至少一个基因组提供至少两个DNA基因组等同物；(b)将DNA分成第一层分开的混合物；(c)扩增分开的混合物中的DNA，其中用dNTP群进行扩增，所述dNTP群包含预定的dUTP与dTTP比率(使得所述DNA中的许多胸腺嘧啶被尿嘧啶替换)和预定的5-甲基dCTP与dCTP比率，使得许多胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶替换；(d)除去尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶以形成有缺口的DNA；(e)处理有缺口的DNA以平移所述缺口，直至相反链上的缺口会聚，由此创建平端DNA片段，其中与在没有5-甲基胞嘧啶的情况中生成的片段相比，平端片段具有更小的GC偏离(bias)和更小的覆盖偏离。在又一个实施方案中，本专利技术提供了一种使双链靶核酸片段化的方法，其包括下列步骤：(a)提供基因组DNA；(b)将DNA分成分开的等分试样；(c)扩增分开的等分试样中的DNA以形成多个扩增子，其中用包含dNTP类似物的dNTP群进行扩增，使得扩增子中的许多核苷酸被dNTP类似物替换，且其中在存在选自下组的添加剂的情况中进行扩增：糖原、DMSO、ET SSB、甜菜碱及其任何组合，(c)自扩增子除去dNTP类似物以形成有缺口的DNA；(d)处理有缺口的DNA以平移所述缺口，直至相反链上的缺口会聚，由此创建平端DNA片段，其中与在没有添加剂的情况中生成的片段相比，平端片段具有更小的GC偏离。在又一个实施方案中，本专利技术提供了自基因组获得序列信息的方法，其包括下列步骤：(a)提供所述基因组的第一片段群；(b)制备第一片段的乳剂液滴，使得每个乳剂液滴包含第一片段群的亚组；(c)获得每个乳液液滴内的第二片段群，使得第二片段比衍生它们的第一片段短；(d)组合第二片段的乳剂液滴与衔接头标签的乳剂液滴；(e)连接第二片段与衔接头标签以形成加标签的片段；(f)将加标签的片段组合成单一组合物；(g)自加标签的片段获得序列阅读，其中序列阅读包括来自衔接头标签和片段的序列信息以鉴定来自相同乳剂液滴的片段，由此提供关于基因组的序列信息。附图简述图1是用于使核酸片段化的方法的实施方案的示意图。图2是用于使核酸片段化的方法的实施方案的示意图。图3是引物浓度在MDA反应中对GC偏离的影响的图。图4显示了DMSO和引物浓度在MDA反应中对变异性(图4A)和GC偏离(图4B)的影响。图5显示了SSB(图5A)和甜菜碱(图5B)在MDA反应中对GC偏离的影响。图6是用于生成包含多个衔接头的环形核酸模板的本专利技术实施方案的示意图。图7是用于控制插入靶核酸中的衔接头的取向的本专利技术实施方案的示意图。图8是不同取向的例示性实施方案的示意图，其中可以彼此连接衔接头和靶核酸分子。图9是用于装配本专利技术的核酸模板的方法的一个方面的示意图。图10是可用于控制此类衔接头插入靶核酸中的方式的衔接头构件的示意图。图11是用于将衔接头插入靶核酸中的臂连臂连接过程的实施方案的示意图。图11A显示了臂连臂连接过程的例示性实施方案，而图11B显示了此过程中使用的衔接头臂的例示性构件。图12是衔接头插入的可能取向的示意图。图13是切口平移连接方法的一个实施方案的示意图。图14是用于插入多个衔接头的方法的一个实施方案的示意图。图15是切口平移连接方法的一个实施方案的示意图。图16是切口平移连接方法的一个实施方案的示意图。图17是利用切口平移环反转(nick translation circle inversion)(图17A)以及切口平移环反转结合尿嘧啶降解(图17B)的切口平移连接方法的一个实施方案的示意图。图18是切口平移连接方法的一个实施方案的示意图。图19是用于插入多个衔接头的方法的一个实施方案的示意图。图20是用于插入多个衔接头的方法的一个实施方案的示意图。图21是用于插入多个衔接头的方法的一个实施方案的示意图。图22是用于插入多个衔接头的方法的一个实施方案的示意图。图23是构象探针锚定连接方法的一个实施方案的示意图。图24是构象探针锚定连接方法的一个实施方案的示意图。图25是构象探针锚定连接方法的一个实施方案的示意图。图26是构象探针锚定连接方法的一个实施方案的示意图。图27是用于给核酸片段加标签的方法的一个实施方案的示意图。图28(A)-(F)是本专利技术的长片段阅读的一个实施方案的步骤的示意性概述。图29是使用本专利技术的长片段阅读技术的一个实施方案以限定单元型的示意性概述。图30A是本专利技术的长片段阅读技术的一个实施方案的示意性概述。图30B是制备用于长片段阅读技术的片段的例示性方法的示意性概述。专利技术详述除非另外说明，可以采用有机化学、高分子技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学领域内的常规技术和描述来实施本专利技术。这些常规技术包括高分子阵列合成、杂交、连接和利用标记物检测杂交。参考下文中的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.15 US 61/187,1621.一种将双链靶核酸片段化的方法，所述方法包括：
(a)提供基因组DNA；
(b)将所述DNA分成第一层分开的等分试样；
(c)扩增所述分开的等分试样中的所述DNA以形成多个扩增子，其中用
dNTP群进行所述扩增，其中所述dNTP群包含：
(i)预定的dUTP与dTTP比率，使得所述DNA中的许多胸腺嘧啶被尿
嘧啶替换；
(ii)预定的5-甲基dCTP与dCTP比率，使得许多胞嘧啶被5-甲基胞嘧
啶替换；
(d)自所述扩增子除去所述尿嘧啶和所述5-甲基胞嘧啶以形成有缺口的
DNA；
(e)处理所述有缺口的DNA 以平移所述缺口，直至相反链上的缺口会聚，
由此创建平端DNA片段，
其中与在没有5-甲基胞嘧啶的情况中生成的片段相比，所述平端片段具
有更小的GC偏离和更小的覆盖偏离。
2.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括自所述第一层的每个分
开的等分试样的片段获得许多序列阅读。
3.权利要求1-2的方法，所述方法进一步包含将所述片段分成第二层分
开的等分试样。
4.权利要求3的方法，所述方法进一步包含自所述第二层中的每个分开
的等分试样的片段获得许多序列阅读。
5.权利要求1-4的方法，其中所述分开的等分试样具有小于1μl、100nl、
10nl、1nl或100pl的体积。
6.权利要求1-5的方法，其中在存在选自下组的成员的情况中进行所述
扩增步骤(b)：糖原、DMSO、ET SSB、甜菜碱、及其任何组合。
7.权利要求1-6的方法，其中所述平端DNA片段具有约100kb至约1mb的
长度。
8.一种将双链靶核酸片段化的方法，所述方法包括：
(a)提供基因组DNA；
(b)将所述DNA分成分开的等分试样；
(c)扩增所述分开的等分试样中的所述DNA以形成多个扩增子，其中：
(i)用包含dNTP类似物的dNTP群进行所述扩增，使得所述DNA中的
许多核苷酸被所述dNTP类似物替换；并
(ii)在存在选自下组的添加剂的情况中进行所述扩增：糖原、DMSO、
ET SSB、甜菜碱、及其任何组合；
(c)自所述扩增子除去所述dNTP类似物以形成有缺口的DNA；
(d)处理所述有缺口的DNA酸以平移所述缺口，直至相反链上的缺口会
聚，由此创建平端DNA片段，
其中与在没有所述添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：R德马纳克，BA彼得斯，A亚历克斯埃夫，P洪，
申请(专利权)人：考利达基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：