单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。该构建方法包括以下步骤：从单细胞中制备cDNA样品；对cDNA样品进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对cDNA样品进行片段化，且对片段化的cDNA样品无需进行纯化的步骤。本发明专利技术通过采用物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化，使破碎片段较小且相对均匀，进而使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中；且片段化后的样品不经纯化步骤减少了样品损失不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。

【技术实现步骤摘要】
单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用
本专利技术涉及高通量测序
，具体而言，涉及一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。
技术介绍
随着现代生物学的发展，细胞群体的研究已不再能满足科研的需求，单细胞研究不仅能解决组织细胞所不能解决的细胞异质性问题，而且还为解析单细胞的行为、机制以及与机体的关系提供了新的研究方向。目前，将高通量测序运用于单细胞研究的单细胞测序成为时下单细胞研究的一种新途径，主要包括单细胞全基因组测序及单细胞转录组测序。对于单细胞转录组测序来说，转录组测序文库的构建是主要的难点，因为单细胞中mRNA含量低至10pg，无法通过常规的RNA转录组文库的构建方法来构建。因此，目前市场上能够利用如此少量的mRNA进行单细胞转录组测序文库构建的产品只有Illumina公司的 DNA 文库构建试剂盒(iIlumina Nextera XT DNA sample preparat1n kit)。Illumina公司的该试剂盒是采用化学方法对样品进行片段化，即用转座酶对cDNA进行打断的方式建库。其具体流程图1所示，单细胞经裂解后，mRNA经反转录得到cDNA，然后对cDNA进行预扩增后，采用转座酶打断的方式对cDNA进行片段化处理。于此同时，转座酶在打断后同时会在破碎片段的两端加上接头，然后再经PCR对片段进行富集，该步骤中PCR的引物会在破碎片段的两端带上标签序列(index)，加标签序列的目的是给不同的样品带上不同的标签，以便从得到的混合测序数据中分离出各样品所对应的测序数据。Illumina公司的上述DNA文库构建试剂盒具有能从低至Ing的样品起始量进行文库构建的巨大优势，但也存在文库上机定量的不准，数据量产出不稳定的问题。因为如果是数据产出过量，浪费成本；如果产量不足，还需要后期额外加测，耽误项目周期。因此，仍需要对现有的单细胞转录组测序文库构建方法进行改进，以使所构建的转录组测序文库能够满足数据量产出稳定的要求。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用，以提高文库的数据量的产出稳定性。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤:从单细胞中制备cDNA样品；对cDNA样品进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。进一步地，上述对cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括:步骤SI，对cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化样品不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞的转录组测序文库。进一步地，上述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化时的参数设置为:循环数8%~12%，峰值入射功率170~180瓦；循环数/爆发200~220个；时间300~360s ;温度4~8°C。进一步地，自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化后得到的片段化样品的长度为150~200bp。进一步地，在得到片段化样品之后，以及对片段化样品进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的ThermoScientific DNA SpeedlllV 离心浓缩系统。进一步地，在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括10 X的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对所述修复后样品进行接头连接；在所述步骤S4中采用KAPA B1公司的2 X的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品进行扩增。进一步地，当片段化样品的量低至3ng时，在步骤S3中，对接头进行稀释后再进行接头连接；优选将接头稀释至1.0~2.0 μ M ;更优选稀释至1.5 μ Μ。 进一步地，在步骤S4中，扩增采用其中一条上带有标签序列的扩增引物进行扩增，优选标签序列为扩增引物上的一段6~10个按特定顺序排列的碱基序列；更优选扩增引物的序列为带有标签序列的SEQ ID N0.1:5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’和不带有标签序列的SEQ ID N0.2:5，-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，。进一步地，在步骤S4中，扩增的循环次数为10~15次，优选13次。根据本专利技术的另一方面，提供了一种上述任一种构建方法在研究细胞异质性方面的应用。应用本专利技术的技术方案，通过采用物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化，使破碎片段大小较小且相对均匀，使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中；且片段化后的样品不经过纯化步骤减少了样品的损失使得本专利技术的构建方法不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。【附图说明】构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中:图1示出了现有技术的单细胞转录组测序文库的构建流程；图2示出了采用现有技术所构建的单细胞转录组测序文库的插入片段大小及峰宽；图3示出了本专利技术的实施例中所采用的单细胞转录组测序文库的构建流程；图4示出了本专利技术的实施例中单细胞的RNA样品经反转录后得到的全长cDNA的大小；图5示出了本专利技术的实施例中所构建的猪卵细胞转录组测序文库的插入片段大小及峰宽；图6示出了本专利技术的实施例中所构建的猪卵细胞转录组测序文库中碱基含量及碱基分布情况；以及图7示出了本专利技术的实施例中所构建的猪卵细胞转录组测序文库上机测序后实际所得的片段化样品的大小分布。【具体实施方式】需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。在本专利技术中的术语“单细胞”是指单一类型细胞的单个细胞；“微量样品”是指起始量在3~20ng的cDNA样品。正如背景技 术部分提到的，Illumina公司的DNA文库构建试剂盒中所提供的文库构建方法是采用转座酶随机打断的方式进行片段化，且片段化和连接头在同一步骤中完成，减少了单独片段化和加接头步步骤后对各自产物进行纯化的步骤，有效降低了样品的损失，具有起始样品量低(通常为2~15ng，最低可达Ing)的极大优势而倍受推崇。然而，本专利技术的专利技术人通过对上述试剂盒的使用和研究发现，采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：从单细胞中制备cDNA样品；对所述cDNA样品进行片段化文库构建，得到所述单细胞的转录组测序文库；其中，所述片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对所述cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞的转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤: 从单细胞中制备CDNA样品； 对所述cDNA样品进行片段化文库构建，得到所述单细胞的转录组测序文库； 其中，所述片段化文库构建步骤中采用物理破碎的方式对所述cDNA样品进行片段化，且对片段化的产物无需进行纯化的步骤。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，对所述cDNA样品进行片段化文库构建的步骤包括: 步骤SI，对所述cDNA样品采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品； 步骤S2，对所述片段化样品不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品； 步骤S3，对所述修复后样品进行接头连接，得到带接头样品； 步骤S4，对所述带 接头样品进行扩增，得到所述单细胞的转录组测序文库。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化；优选所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化时的参数设置为:循环数8%~12%，峰值入射功率170~180瓦；循环数/爆发200~220个；时间300~360s ;温度4~8V。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA样品进行片段化后得到的所述片段化样品的长度为150~200bp。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述片段化样品之后，以及对所述片段化样品进行所述末端修复的步骤之前，还包括对所述片段化样品进行浓缩的步骤；优选米用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific...

【专利技术属性】
技术研发人员：王大伟，王苗英，王棪，曹志生，刘运超，朱海浩，
申请(专利权)人：北京诺禾致源生物信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11