基于高通量测序的TCR多样性检测和文库构建制造技术

本发明专利技术涉及构建TRB基因的可变区(V区)的测序文库的方法，和用于该方法的试剂盒。进一步地，所述测序文库通过应用新一代测序技术来对TCR免疫库中的TRB基因V区表达信息进行快速方便、低成本的检测和鉴定。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及构建TRB基因的可变区(V区)的测序文库的方法，和用于该方法的试剂盒。所述测序文库通过应用新一代测序技术来对TCR免疫库中的TRB基因V区表达信息进行快速方便、低成本的检测和鉴定。专利技术背景淋巴细胞通过其表面抗原识别受体识别特异性抗原，其对抗原识别的特异性体现在克隆水平，即同一克隆的淋巴细胞具有相同的抗原受体，识别同一抗原表位。T细胞抗原受体(Tcellantigenreceptor,TCR)是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，可以由α和β肽链，或者由γ和δ肽链组成。TRB(T细胞受体β基因座，TCellReceptorBetaLocus)是编码TCR分子中β肽链的基因位座。原始状态下TRB基因座包含V(variable)、J(joining)、D(diversity)和C(constant)四个基因区域，其中V、D、J各包含若干等位基因。在T细胞发育过程中，TRB基因座内发生DNA重组，首先一个D基因与一个J基因重组连接，紧接着一个V基因与之发生重组，最后C段在RNA转录后加工修饰的过程中，通过减掉内含子与VDJ基因相连。TRB基因位座在该重组过程中通过选择不同的V、D、J等位基因，以及在重组位点附近碱基的随机插入和缺失等机制，使得最终翻译形成多样性极高的β肽链，以满足机体识别抗原的需要。TCR的α和β肽链各有三个高度可变区(统称为V区)，又称为互补决定区(CDR)，即CDR1、CDR2和CDR3。其中CDR3由于其在TCR识别抗原过程中的核心地位，以及序列的高度可变性，被认为是T细胞克隆来源的标识。得益于新一代测序技术的发展，对整个T细胞群中TCR的CDR3同步测序成为现实。Gerlinger等通过对TCR深度测序发现了每种肿瘤位置的多克隆T细胞库具有约367–16,289个独特TCRb序列，独特T细胞克隆数在例如3780-25,930的范围内(GerlingerM等，Ultra-deepTcellreceptorsequencingrevealsthecomplexityandintratumourheterogeneityofTcellclonesinrenalcellcarcinomas.JPathol.2013；231(4):424-432)。虽然测序技术具有低样品需求、可扩展的超高通量和高质量的数据等多种优点，然而当前CDR3序列鉴定时面临的一个问题是，测序的引物较难设计，测序错误率较高。此外，在进行测序前首先要扩增CDR3的cDNA序列并构建文库。传统多重PCR虽然易于操作，但由于扩增过程中模板拷贝数与扩增效率难以控制，使得扩增产物往往发生漂移，违背了初始的分布状态。而且随着反应体系内引物数量的增加，加上引物复杂度高，彼此影响，更容易产生PCR扩增偏倚，错误引发扩增和引物相互干扰的机会大大增加，表现为多重PCR反应体系内多个分子靶点的扩增不兼容、扩增背景过高、可重复性差等问题，给测序结果也带来了不利影响。因此，本领域需要一种避免后续标准建库中的PCR偏倚，优选在获得目的片段的同时完成文库构建，从而直接用于高通量测序的方法。专利技术概述本专利技术提供构建TRB基因V区的测序文库的方法，其包括通过PCR来扩增TRB基因的V区的cDNA序列，其中通过使用包含测序接头的部分或全部序列的引物在PCR扩增过程中将测序接头的该序列掺入扩增产物的两端。在一个方面，所述方法包括如下两轮PCR：(a)使用一组引物扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；和(b)以第一轮PCR产物为模板，采用另一组引物进行第二轮PCR扩增；其中所述另一组引物在一端含有所述测序接头的部分或全部序列，其正向引物和反向引物在另一端分别与第一组引物的正向引物和反向引物重叠以将第一轮PCR产物作为模板进行扩增。在进一步的一个方面，所述方法包括其中所述第一组引物在一端含有所述测序接头的第一部分序列，所述另一组引物在一端含有所述测序接头的第二部分序列或由所述测序接头的第二部分序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。在另一个方面，所述方法还可以包括在进行第一轮PCR之前先进行一轮PCR，该轮PCR中使用不含测序接头序列的部分的引物从而与靶物完全退火。此种情况下，该轮PCR与第一轮PCR可构成巢式PCR，即该轮PCR中使用的引物是巢式PCR的外侧引物，而相应地第一轮PCR中使用的引物是巢式PCR的内侧引物。本专利技术还提供构建TRB基因V区的测序文库的方法，包括将总RNA反转录成cDNA，然后通过巢式PCR来扩增TRB基因V区。优选地，在扩增过程中在扩增产物的两端掺入测序用接头的至少一部分。更优选地，所述至少一部分是测序用接头的全长。在一个实施方案中，所述方法包括如下三轮PCR：(a)使用第一组引物从所述cDNA扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；(b)以第一轮PCR的产物为模板，采用第二组引物进行第二轮PCR扩增；和(c)以第二轮PCR产物为模板，使用第三组引物进行第三轮PCR扩增；其中所述第二组引物在一端含有测序接头的部分序列，第三轮PCR中使用的第三组引物的正向引物和反向引物在一端分别与第二组引物的正向引物和反向引物重叠以将第二轮PCR产物作为模板进行扩增。进一步地，所述第三组引物可以包含另一部分的测序接头序列或由另一部分的测序接头序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。在一个例示的实施方案中，第一轮PCR可以使用包括反向引物TRBCRo(SEQIDNo:1)和正向引物TRBVFo(包括TRBV1Fo-TRBV30Fo，SEQIDNo:2-30)在内的第一组引物，从反转录获得的cDNA扩增TRBV基因；接着以第一轮PCR产物为模板，采用包括反向引物TRBCRi(SEQIDNo:31)和正向引物TRBVFi(包括TRBV1Fi-TRBV30Fi，SEQIDNo:32-65)在内的第二组引物，进一步扩增；然后，任选地在移除或不移除第一组和第二组引物的情况下，继续以第二轮PCR产物为模板，使用包括正向引物SuperF(SEQIDNo:66)和反向引物SuperR(SEQIDNo:67)在内的第三组引物，进一步扩增。在该方法中，第二轮PCR中使用的引物序列TRBVFi可以含有Illumina测序平台的部分接头序列，第三轮PCR中使用的引物SuperF和SuperR的序列在一端分别与TRBVFi和TRBCRi重叠/相同以便以第二轮PCR的产物为模板进一步扩增(如图3所示)。在一个实施方案中，SuperR可以包含有6-8个碱基的barcode作为每个样品PCR产物的独有标记。所述方法可以进一步包括通过Illumina测序技术对获得的TRB基因V区的测序文库进行测序。在一个优选的实施方案中，所述测序适用于IlluminaHiSeq2000测序仪，以双端250bp(PE250)方法检测。由于现有Illumina测序平台上使用的接头序列是一样的，因此所述方法也可以用于其他Illumina测序方案，例如针对MiSeq测序仪的建库方案，以双端测序300bp(PE300)方法检测。在上文所述的方法中，在PCR扩增前可能需要先从受试者样品提取总RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建TRB基因V区的测序文库的方法，其包括通过PCR来扩增TRB基因的V区的cDNA序列，其中通过使用包含测序接头的部分或全部序列的引物在PCR扩增过程中将测序接头的该序列掺入扩增产物的两端。

【技术特征摘要】
1.构建TRB基因V区的测序文库的方法，其包括通过PCR来扩增TRB基因的V区的cDNA序列，其中通过使用包含测序接头的部分或全部序列的引物在PCR扩增过程中将测序接头的该序列掺入扩增产物的两端。2.权利要求1的方法，其包括如下两轮PCR：(a)使用一组引物扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；和(b)以第一轮PCR产物为模板，采用另一组引物进行第二轮PCR扩增；其中所述另一组引物在一端含有所述测序接头的部分或全部序列，其正向引物和反向引物在另一端分别与第一组引物的正向引物和反向引物重叠以将第一轮PCR产物作为模板进行扩增。3.权利要求2的方法，其中所述第一组引物在一端含有所述测序接头的第一部分序列，所述另一组引物在一端含有所述测序接头的第二部分序列或由所述测序接头的第二部分序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。4.权利要求2或3的方法，其还包括在进行第一轮PCR之前先进行一轮PCR，该轮PCR中使用不含测序接头序列的部分的引物，从而与靶DNA片段完全退火。5.权利要求4的方法，其中该轮PCR与第一轮PCR构成巢式PCR。6.权利要求1的方法，其包括如下三轮PCR：(a)使用第一组引物从所述cDNA扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；(b)以第一轮PCR的产物为模板，采用第二组引物进行第二轮PCR扩增；和(c)以第二轮PCR产物为模板，使用第三组引物进行第三轮PCR扩增；其中所述第二组引物在一端含有所述测序接头的部分序列，第三轮PCR中使用的第三组引物的正向引物和反向引物在一端分别与第二组引物的正向引物和反向引物重叠以将第二轮PCR产物作为模板进行扩增。7.权利要求6的方法，其中所述第三组引物包含另一部分的测序接头序列或由另一部分的测序接头序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。8.权利要求7的方法，其中所述第一组引物包括反向引物SEQIDNo:1和正向引物SEQIDNo:2-30。9.权利要求7的方法，其中所述第二组引物包括反向引物SEQIDNo:31和正向引物SEQIDNo:32-65。10.权利要求7的方法，其中所述第三组引物包括反向引物SEQIDNo:67和正向引物SEQIDNo:66。...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯林，肖汀，程书钧，张开泰，匡满超，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京;11