用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法技术

本发明专利技术提供了一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。具体地涉及一种改进的重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。该建库方法包括：单细胞裂解；重亚硫酸氢盐处理；以重亚硫酸氢盐处理产物为模板的一链及二链合成；以及以二链合成产物为模板构建测序用文库。其中在重亚硫酸氢盐处理后的纯化步骤中，加入了tRNA，提高了处理产物的纯化及回收效率。采用本发明专利技术的文库构建方法，减少了样本的损失，提高了测序数据的比对率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测领域，具体地说，涉及一种用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。
技术介绍
DNA甲基化(DNAmethylation)是真核生物基因组DNA的一种重要的表观遗传学修饰，即在DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团共价结合到DNA分子的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。DNA甲基化在维持高等生物正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、衰老以及人类肿瘤的发生等生物学过程中起着重要作用。在无脊椎动物中，基因组DNA甲基化通过调控基因的表达模式，参与调节机体对环境的适应过程。因此，获得全基因组范围内所有胞嘧啶位点的甲基化数据，对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。现有的BisulfiteSequencing(重亚硫酸氢盐测序)将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，经PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来。Bisulfite处理与高通量测序技术相结合，可精确分析每一个C碱基的甲基化状态，从而来绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联，为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。当前普遍采用的方法是从大量的组织样品中获取基因组DNA进行测序。但此传统方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达，往往会掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的甲基化修饰差异。并且，在健康组织或肿瘤等病变组织中，某些细胞的数量稀少，除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进行分析。Sebastien等提出了单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序技术，流程包括：(1)采集单细胞；(2)将采集的单细胞进行裂解，得到裂解后的单细胞样本；(3)将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢盐处理产物；(4)以上述的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；(5)使用链霉亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；(6)以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及(7)以所述合成的第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。但是，该方法做出的实验分析结果中，数据的比对率(UniqueMappedRatio)较低。参考文献[1]SébastienSmallwoodSA,LeeHJetal.2014.Single-cellgenome-widebisulfitesequencingforassessingepigeneticheterogeneity.Naturemethods,8,11(8):817-820.
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，以及用于测定单细胞基因组DNA样本的甲基化位点的试剂盒。以提高数据比对率(UniqueMappedRatio)。1.一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：步骤A：将单细胞进行裂解，得到裂解后的单细胞样本；步骤B：将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，加入tRNA进行纯化，得到纯化后的重亚硫酸氢盐处理产物；步骤C：以步骤B所述重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；步骤D：使用链霉亲和素磁珠调取所述步骤C合成的生物素标记的第一条链；步骤E：以步骤D所述调取的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链，获得合成第二条链的产物；以及步骤F：以所述合成第二条链的产物为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。2.根据项1所述的文库构建方法，其中步骤B中tRNA的使用量为10ng。3.根据项1所述的文库构建方法，其中所述单细胞来源于哺乳动物、植物和/或微生物。4.根据项1所述的文库构建方法，其中步骤C所述SEQIDNO：1引物序列：5'-(Biotin)TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'。5.根据项1所述的文库构建方法，其中在步骤D之前包括步骤E-1：消化单链DNA。6.根据项1所述的文库构建方法，其中步骤E使用所述SEQIDNO：2引物：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'。7.根据项1所述的文库构建方法，其中，在所述步骤C中对消化处理后的体系进行磁珠纯化，得到纯化的生物素标记的第一条链；和/或在所述步骤D中，对所述PCR扩增的产物进行磁珠纯化。8.根据项7所述的文库构建方法，其中磁珠纯化使用量为0.8倍以上。9.根据项7所述的文库构建方法，其中磁珠纯化使用0.9倍AmpureXP磁珠进行。10.一种用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建的试剂盒，其包括选自下组中的至少一种或全部：用于对所述单细胞进行裂解的试剂；用于对所述单细胞裂解样本进行重亚硫酸氢盐处理试剂；用于对所述重亚硫酸氢盐处理后产物第一条链合成的试剂；用于对所述合成第一条链进行调取的试剂；用于对所述第一条链为模板合成第二条链的试剂；用于对所述第二条链为模板进行PCR扩增的试剂。有益效果：本专利技术能够从单细胞量起始量中，扩增得到可供后续重亚硫酸氢盐测序使用的高通量文库，结果提高了数据比对率，扩展了表观遗传学甲基化检测的使用范围，具有重要的生物学意义。附图说明图1为样本Ser1安捷伦2100检测结果图2为样本Ser2安捷伦2100检测结果专利技术的具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。本专利技术方法包括：步骤A：采集单细胞；步骤B：将采集的单细胞进行裂解，得到裂解后的单细胞样本；步骤C：将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，加入tRNA进行纯化，得到重亚硫酸氢盐处理产物；步骤D：以上述重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；步骤E：使用链霉亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；步骤F：以步骤D所述调取的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链，获得合成第二条链的产物；以及步骤G：以所述合成的第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。在本专利技术所使用的单细胞可以源于哺乳动物、植物或/和微生物。根据本专利技术的一些实施例，哺乳动物可以为人和小鼠的至少一种，根据本专利技术的一个实施例，样本为一个来自于小鼠MII期的卵母细胞。本专利技术人经研究发现，在所述步骤C中，对单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理加入tRNA，可提高最后测序结果的比对率。因此为了更好地显现本专利技术的技术效果，优选使用5～20ng的tRNA，更优选10ng的tRNA。在本实施例中使用10ngtRNA，对于所述步骤C中采用的重亚硫酸氢盐处理体系及反应条件没有特殊限制，本领域技术人员可以适宜选择能够在重亚硫酸氢盐处理过程中使用的那些体系及反应条件。在第一条链合成反应完毕后，体系中还会有一些DNA以单链形式存在，例如未用完的含生物素标记的oligo1引物。在所述步骤E中，使用核酸外切酶消化这些本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：步骤A：将单细胞进行裂解，得到裂解后的单细胞样本；步骤B：将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，加入tRNA进行纯化，得到纯化后的重亚硫酸氢盐处理产物；步骤C：以步骤B所述重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的SEQ ID NO：1合成第一条链；步骤D：使用链霉亲和素磁珠调取所述步骤C合成的生物素标记的第一条链；步骤E：以步骤D所述调取的第一条链为模板，使用SEQ ID NO：2引物合成第二条链，获得合成第二条链的产物；以及步骤F：以所述合成第二条链的产物为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。

【技术特征摘要】
2015.12.31 CN 20151103061451.一种单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：步骤A：将单细胞进行裂解，得到裂解后的单细胞样本；步骤B：将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，加入tRNA进行纯化，得到纯化后的重亚硫酸氢盐处理产物；步骤C：以步骤B所述重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的SEQIDNO：1合成第一条链；步骤D：使用链霉亲和素磁珠调取所述步骤C合成的生物素标记的第一条链；步骤E：以步骤D所述调取的第一条链为模板，使用SEQIDNO：2引物合成第二条链，获得合成第二条链的产物；以及步骤F：以所述合成第二条链的产物为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其中步骤B中tRNA的使用量为10ng。3.根据权利要求1所述的文库构建方法，其中所述单细胞来源于哺乳动物、植物和/或微生物。4.根据权利要求1所述的文库构建方法，其中步骤C所述SEQIDNO：1序列：5'-（Biotin）TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳青，王晓雯，洪燕，赵红梅，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11