一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，包括以下步骤：对大黄鱼进行全基因组重测序，并进行大黄鱼全基因组SNP/InDel挖掘，提供高质量的SNP标记位点；筛选利用大黄鱼的全基因组重测序挖掘到的SNP标记，用于设计探针；利用大黄鱼的全基因组构建大黄鱼基因组文库；利用液相捕获大黄鱼基因组片段；对捕获大黄鱼基因组片段进行高通量测序与SNP/InDel基因分型。本发明专利技术有效地避免了全基因简化基因组分型技术可能导致的标记密度不均匀和大部分来自非编码区标记的问题。本发明专利技术设计4条探针，有效的提高了每个SNP所在序列的杂交的特异性，提高了片段捕获的效率；在大黄鱼特定标记的SNP大规模分型上具有重要的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因分型
，具体是一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法。
技术介绍
分子标记是指生物个体或则群体在基因组序列上表现的特征性差异。单核苷酸多态性（SNP）和短片段插入和缺失(InDel)是生物基因组上一个或几个碱基差异导致的个体间的多态性的位点，是一类重要的分子标记。SNP被许多人认为是未来最佳的标记选择，具有稳定遗传, 分布广泛，等位基因频率容易估计，具有重要的生物学意义，且适合大规模检测等特点。目前，SNP/InDel标记已经是生物种群鉴定，遗传结构分析，连锁图谱构建，重要性状连锁分析和功能性基因定位的重要工具。随着高通量SNP/InDel基因分型技术的发展，目前无参考基因序列的非模式生物体全基因组SNP标记的开发一般有转录组，全基因组或者简化基因组测序的方法。但是由于基因编码区域只占全基因组的2%左右，上述方法都无法预知或者指定开发的SNP标记的位置，导致全基因组开发的SNP标记大多来自于非基因编码区域。所以，对于有参考基因组序列的物种，科研人员一般利用已知的序列设计SNP芯片。利用随机打断的基因组DNA片段与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交，就可以获知对应位点的SNP/InDel基因分型。SNP芯片虽然可以预先设定分子标记的位置，但是由于芯片设计程序复杂，成本过高，难以在实际应用上对不同物种大面积推广。大黄鱼属石首鱼科，黄鱼属，为暖温性近海中下层集群性洄游鱼类，主要分布于中国和东亚。在中国主要分布于南海、东海和黄海南部，为福建和浙江等沿海地区的重要经济鱼类之一。2014年大黄鱼的国内产量约为12吨，为我国最大的海水养殖鱼类，具有巨大的经济价值。但是国内超高密度养殖，以及多代未加选育的人工繁殖，导致大黄鱼生长速度变慢，口感变差，脂肪含量过高，严重影响了大黄鱼养殖产业的健康发展。为了对大黄鱼的重要经济性状进行人工选育，我们首先必须获得大量的大黄鱼全基因组的SNP分子标记。随着近些年大黄鱼基因组序列的破译和相关重要经济性状显著相关的分子标记的研究，需要在全基因特定位置的SNP/InDel位点进行大规模的基因分型。但是基因芯片的设计复杂且成本昂贵，难以应用到大黄鱼特定位点SNP/InDel高通量分型领域，急需一种可以低成本的获得大黄鱼特定基因组片段进行可靠基因分型的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，包括以下步骤：1）对大黄鱼进行全基因组重测序，并进行大黄鱼全基因组SNP/InDel挖掘，提供高质量的SNP标记位点；2）筛选利用大黄鱼的全基因组重测序挖掘到的SNP标记，用于设计探针；3）利用大黄鱼的全基因组构建大黄鱼基因组文库；4）利用液相捕获大黄鱼基因组片段；5）对捕获大黄鱼基因组片段进行高通量测序与SNP/InDel基因分型。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤1）中，充分利用大黄鱼多个个体混合基因组重测序数据，使用SOAPaligner将测序读段比对到大黄鱼参考基因组序列上。使用SOAPsnp软件进行全基因组的SNP挖掘，只保留高质量的SNP位点用于后续分析（质量值≥20和深度≥10）；作为本专利技术进一步的方案：所述步骤2）中SNP标记位点进行筛选大黄鱼的SNP捕获位点，筛选的原则是：（1）尽量保证标记在全基因组均匀分布；（2）筛选SNP标记前后100bp没有其他的SNP标记干扰；（3）筛选的SNP有一半来自于蛋白编码基因和miRNA，另一半来自于全基因组非编码区；（4）保证每个基因都能捕获其中的一个外显子。以每个SNP位点为中心，在其四周设计4条相互重叠的探针，最大限度地保证捕获到的序列能够覆盖SNP位点。探针设计示意图见图1。合成SNP单链捕获探针，并在探针上结合生物素标记，构建大黄鱼基因组SNP液相捕获系统。作为本专利技术进一步的方案：步骤3）中，大黄鱼基因组文库构建：采用超声波打断的方法，对大黄鱼的全基因组进行片段化，并通过末端补平，加adaptor等步骤，获得大黄鱼基因组文库。利用Nanodrop 2000或Qubit对大黄鱼基因组文库的质量进行检测。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤4）中将含有生物素的探针和链霉亲和素覆盖的磁珠混合，通过探针上的生物素和streptavidin（链霉亲和素）的结合被吸附到磁珠上；通过洗脱处理就能将非目标区域的DNA片段洗掉，从而富集要求的大黄鱼基因组片段。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤5）中捕获的大黄鱼基因组片段加上测序接头和样本特异标签后，利用PCR进行片段扩增；扩增产物利用高通量测序平台进行测序；测序数据通过SOAPaligner和SOAPsnp软件处理后得到个体特定位点的SNP/InDel基因分型。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的提供了一种利用全基因组SNP捕获系统对大黄鱼全基因组SNP标记进行捕获分型的技术。探针设计的时候考虑到了捕获的SNP标记在全基因组的分布情况，而且捕获探针各设计了2.5万个标记来自于基因或者miRNA转录区域和非编码区，有效地避免了全基因简化基因组分型技术可能导致的标记密度不均匀和大部分来自非编码区标记的问题。同时，本专利技术对每个SNP标记取前后各100bp，设计4条探针，有效的提高了每个SNP所在序列的杂交的特异性，提高了片段捕获的效率。本专利技术理论上可以对任何特定的SNP标记设计捕获探针，因而本专利技术在大黄鱼特定标记的SNP大规模分型上具有重要的应用，为大黄鱼的遗传多样性分析、品系鉴定、标记辅助选育研究和应用提供了高效的基因组分型技术。附图说明图1是本专利技术基因组片段SNP位点捕获探针设计示意图。图2是本专利技术中SNP捕获与测序流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本专利技术实施例中，一种用于大黄鱼全基因组基因分型的液相捕获方法：1.利用大黄鱼重测序数据鉴于上述用于基因组测序的个体是高度纯合的个体，杂合位点/SNP位点很少，因此，于2012年9月从不同养殖群体中挑选了100尾大黄鱼（雌雄各50尾），通过构建300bp的小片段文库进行了基因组重测序。该2组重测序共获得raw data 20Gb，平均测序深度达到了26.8。2.确定捕获位点，探针设计将测序结果比对到上述基因组草图上进行SNP标记挖掘。共获得测序深度大于5X的SNP位点12161573个，外显子上505286个，内含子上4949058个，基因间5135488个。根据外显子上的捕获位点2.5万个、非基因区捕获位点2.5万个，以及所有捕获位点尽可能在基因组中均匀分布（覆盖尽可能多的Scaffold）的设计原则，挑选5万个目标位点设计了捕获探针。3.大黄鱼样本获得与基因组DNA提取选取以上大黄鱼家系中个体存活数最多的LG家系，选取其中52个样本及其亲本的鳍条进行基因组DNA的提取。提取方法为上海捷瑞生物工程有限公司的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对大黄鱼进行全基因组重测序，并进行大黄鱼全基因组SNP/InDel挖掘，提供高质量的SNP标记位点；2）筛选利用大黄鱼的全基因组重测序挖掘到的SNP标记，用于设计探针；3）利用大黄鱼的全基因组构建大黄鱼基因组文库；4）利用液相捕获大黄鱼基因组片段；5）对捕获大黄鱼基因组片段进行高通量测序与SNP/InDel基因分型。

【技术特征摘要】
1.一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对大黄鱼进行全基因组重测序，并进行大黄鱼全基因组SNP/InDel挖掘，提供高质量的SNP标记位点；2）筛选利用大黄鱼的全基因组重测序挖掘到的SNP标记，用于设计探针；3）利用大黄鱼的全基因组构建大黄鱼基因组文库；4）利用液相捕获大黄鱼基因组片段；5）对捕获大黄鱼基因组片段进行高通量测序与SNP/InDel基因分型。2.根据权利要求1所述的利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，其特征在于，所述步骤1）中，充分利用大黄鱼不少于1个个体混合基因组重测序数据，使用SOAPaligner将测序读段比对到大黄鱼参考基因组序列上；使用SOAPsnp软件进行全基因组的SNP挖掘，只保留高质量的SNP位点用于后续分析，其中高质量的SNP位点的质量值≥20，深度≥10。3.根据权利要求1所述的利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，其特征在于，所述步骤2）中SNP标记位点进行筛选大黄鱼的SNP捕获位点，筛选的原则是：（1）保证SNP标记在全基因组均匀分布；（2）筛选SNP标记前后100bp没有其他的SN...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖世俊，刘洋，王志勇，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35