一种产生苜蓿基因组编辑纯合植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种产生苜蓿基因组编辑纯合植株的方法，属于植物基因工程技术领域。它的主要内容包括：苜蓿毛状根体系建立；将CRISPR/Cas9过表达载体转化苜蓿并获得抗性毛状根；快速筛选苜蓿基因组被定点编辑的纯合毛状根根系；建立毛状根再生体系并利用该体系获得基因组编辑纯合的苜蓿植株。主要用于解决CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株获得工作量大且周期长的难题。采用本发明专利技术的方法能够在1‑2个月内获得苜蓿基因组编辑纯合的毛状根根系；经纯合毛状根根系再生获得的苜蓿株系全部为纯合编辑的植株。

A method for producing alfalfa genomes and editing homozygous plants

The invention discloses a method for producing alfalfa genome and editing a homozygous plant, belonging to the field of plant gene engineering technology. Its main contents include: the establishment of Alfalfa hairy root system; CRISPR/Cas9 expression vector was transformed into Alfalfa and acquired resistance of hairy root; rapid screening of Alfalfa genome editing was designated homozygous hairy root root; establishment of hairy root regeneration system of alfalfa and obtain homozygous genome editing by this system. The invention is mainly used for solving the problems of large workload and long cycle for editing the homozygous genome of the CRISPR/Cas9 genome. The method of the invention can produce hairy roots of alfalfa root genome editing homozygous at 1 within 2 months; the homozygous hairy root root regenerated alfalfa strains are homozygous editing plants.

【技术实现步骤摘要】
一种产生苜蓿基因组编辑纯合植株的方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体地涉及一种产生苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株的方法。
技术介绍
苜蓿作为一种优质豆科牧草，在畜禽生产中发挥着重要作用。其适应性强、栽培历史长、分布范围广，具有生产力稳定、利用年限长、营养价值高、适口性好、饲喂畜禽效果佳、蓄水保土、防风固沙、改土肥田、后作增产和恢复植被、保护生态等应用价值，被誉为“牧草之王”，在农牧业生产中发挥着不可替代的作用。苜蓿中的生物活性成分，如苜蓿多糖、苜蓿皂苷和苜蓿黄酮在改善动物的健康状况、提高动物生产性能和免疫功能方面有较好的效果。此外，苜蓿中的叶蛋白、天然色素和绿原酸等有益成分对畜禽的健康状况及生产性能同样有作用，相信随着科学技术的发展及对苜蓿研究的不断深入，其生物活性成分作为饲料添加剂将有广阔的前景，苜蓿将为畜牧业和饲料工业的发展做出更大的贡献。CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是成簇、有规律间隔、短回文重复序列。CRISPR/Cas系统的发现源自对细菌防御系统的研究。作为一门新兴的基因工程技术，CRISPR/Cas系统能够通过转基因技术手段对作物基因组进行精准编辑，获得与天然突变体类似的种质新资源，从而有效规避转基因产品的市场和环境风险。同时，CRISPR/Cas9技术因设计简单，操作方便，短短几年已成为研究者争相研究的热点。目前，CRISPR/Cas9技术已经在拟南芥、水稻、杨树、大豆等基因组编辑过程中获得了稳定的突变植株，并在烟草、大豆、甜橙、小麦、高粱、玉米等多种植物的叶片或原生质体等瞬时表达系统中进行了基因组编辑，验证了CRISPR/Cas9系统在植物中进行基因组编辑的可行性。目前，第一例基因组编辑蘑菇已经问世，它无需通过美国法规机构的监管程序，可以直接用于种植和销售。然而，CRISPR/Cas9基因组编辑过程中产生的材料多为杂合编辑，如何用一套简洁快速的方法获得纯合编辑，用于解决植物因生长周期长而延长试验周期、基因组编辑后需要大规模筛选鉴定的难题，成为基因组编辑研究工作中非常重要的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产生苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株的方法，提供一种快速高效产生苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株的体系，用于苜蓿重要经济性状的遗传改良和分子设计。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种产生苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株的方法，它的内容包括：苜蓿毛状根遗传转化体系的建立；苜蓿基因组编辑纯合毛状根根系的筛选鉴定；苜蓿基因组编辑纯合植株的获得。进一步，所述的苜蓿毛状根遗传转化体系的建立：针对目的基因设计gRNA，并构建至CRISPR/Cas9基因组编辑表达载体中，然后转入发根农杆菌作为基因工程菌株用于侵染苜蓿外植体，并在诱导筛选培养基(SHS)培养10-14d诱导产生苜蓿毛状根，培养箱温度为25±2℃，暗培养。进一步，所述的苜蓿基因组编辑纯合毛状根根系的筛选鉴定：将诱导产生的毛状根进行随机编号，S1和S2代则随机挑选5-10个单一毛状根进行连续继代培养，培养箱温度为25±2℃，暗培养；同时收集继代后剩余的根段进行DNA提取，PCR扩增包含gRNA在内的目的基因，并进行单酶切鉴定，选择已发生编辑的毛状根的PCR产物进行测序分析，快速筛选获得纯合根系。进一步，所述的苜蓿基因组编辑纯合植株的获得：把筛选鉴定的基因组编辑纯合根系继代到愈伤诱导培养基(SHC)上，经3-5周诱导愈伤细胞产生，然后继代到分化培养基(MSR)上，经3-5周获得再生芽，然后继代到生根培养基(MS0)，经3-4周获得再生苗，培养箱温度为25±2℃，光照时间每天16h光/8h暗。进一步，所述的农杆菌菌株类型为发根农杆菌；其中除了携带Ri质粒外，还携带外源CRISPR/Cas9基因组编辑表达载体质粒；所述的CRISPR/Cas9载体为pYLCRISPR/Cas9系列载体。进一步，抗性筛选试剂为草胺膦(PPT)、潮霉素(Hyg)或卡那霉素(Kan)。进一步，所述的用于毛状根诱导的苜蓿外植体为苜蓿无菌幼苗全株或营养生长期的室外植株叶片。进一步，所述的苜蓿无菌幼苗为种子苗或无菌扩繁苗。进一步，所述种子苗的获得方法为：成熟种子用以下方法进行消毒：70％酒精不超过1min，0.1％升汞5-10min，无菌水洗5遍，将消毒后的种子接种于1/2MS培养基，暗培养催芽，然后移至光周期16h光/8h暗继续培养，10d后随时取用；进一步，所述无菌扩繁苗的获得方法为：无菌苗自顶端生长点下数2-3节处剪下，接种于MS0培养基培养生根，继续培养至生长正常的幼苗，剪茎和包括叶柄在内的叶片为外植体备用。进一步，所述室外植株叶片的消毒方法为：含0.1％吐温的水洗叶片2min，30％NaClO5-10min，无菌水洗至无味。本专利技术中所述的SHS为SH基础培养基添加400mg/L特美汀，15g/L蔗糖，4g/L植物凝胶；另外根据另外根据所使用植物表达载体的抗生素类型分别添加PPT1.5mg/L或Hyg15mg/L或Kan50mg/L作为筛选试剂，pH5.8，121℃高压灭菌15min；本专利技术中所述的SHC为SH基础培养基添加2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，400mg/L特美汀，30g/L蔗糖，4g/L植物凝胶；另外根据所使用植物表达载体的抗生素类型分别添加PPT1.0mg/L或Hyg10mg/L或Kan50mg/L作为筛选试剂，pH5.8，121℃高压灭菌15min，以上各成份浓度均为各成份在培养基中的终浓度；本专利技术中所述的MSR为MS基础培养基添加0.5-1.0mg/L6-BA，1.0mg/L激动素(KT)，400mg/L特美汀，30g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，pH5.8，121℃高压灭菌15min，以上各成份浓度均为各成份在培养基中的终浓度；本专利技术中所述的MS0为1/2MS培养基添加1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)，400mg/L特美汀，10g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，pH5.8，121℃高压灭菌15min，以上各成份浓度均为各成份在培养基中的终浓度。以上所述各成份的浓度均为培养基中的终浓度。所述的CRISPR/Cas9载体可以串联多个gRNA靶序列，目前技术水平可以串联至少8个gRNA，能够显著提高基因组编辑的效率。本专利技术中所述的毛状根生长迅速，能够显著缩短基因组编辑纯合系的筛选周期。本专利技术中所述的毛状根诱导、筛选及扩繁培养基中无需激素添加。本专利技术中所述的gRNA的PAM区附近含有限制性内切酶位点。本专利技术中所述的用于毛状根诱导的外植体来源丰富，包括苜蓿无菌幼苗的根、茎、叶等部位，以及营养生长期的室外植株叶片。本专利技术中所述的基因克隆、gRNA设计、载体构建和农杆菌侵染均可使用基因工程技术及CRISPR/Cas9设计的标准方法实现。本专利技术可用于在苜蓿中成功进行CRISPR/Cas9基因组编辑。本专利技术的核心特点和专利技术理念包括：1)作物基因组编辑如果能够在当代获得纯合的株系，那么将极大降低下一代筛选鉴定的周期和工作量，然而像其他作物一样，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株的方法，其特征在于它的内容包括：苜蓿毛状根遗传转化体系的建立；苜蓿基因组编辑纯合毛状根根系的筛选鉴定；苜蓿基因组编辑纯合植株的获得。

【技术特征摘要】
1.一种产生苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑纯合植株的方法，其特征在于它的内容包括：苜蓿毛状根遗传转化体系的建立；苜蓿基因组编辑纯合毛状根根系的筛选鉴定；苜蓿基因组编辑纯合植株的获得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的苜蓿毛状根遗传转化体系的建立：针对目的基因设计gRNA，并构建至CRISPR/Cas9基因组编辑表达载体中，然后转入发根农杆菌作为基因工程菌株用于侵染苜蓿外植体，并在诱导筛选培养基培养10-14d诱导产生苜蓿毛状根，培养箱温度为25±2℃，暗培养。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的苜蓿基因组编辑纯合毛状根根系的筛选鉴定：将诱导产生的毛状根进行随机编号，S1和S2代则随机挑选5-10个单一毛状根进行连续继代培养，培养箱温度为25±2℃，暗培养；同时收集继代后剩余的根段进行DNA提取，PCR扩增包含gRNA在内的目的基因，并进行单酶切鉴定，选择已发生编辑的毛状根的PCR产物进行测序分析，快速筛选获得纯合根系。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的苜蓿基因组编辑纯合植株的获得：把筛选鉴定的基因组编辑纯合根系继代到愈伤诱导培养基上，经3-5周诱导愈伤细胞产生，然后继代到分化培养基上，经3-5周获得再生芽，然后继代到生根培养基，经3-4周获得再生苗，培养箱温度为25±2℃，光照时间每天16h光/8h暗。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于抗性筛选试剂为草胺膦、潮霉素或卡那霉素；所述的用于毛状根诱导的苜蓿外植体为苜蓿无菌幼苗全株或营养生长期的室外植株叶片。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的农杆菌菌株类型为发根农杆菌；其中除了携带Ri质粒外...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，张海玲，曹英萍，尚晨，李佶恺，王建丽，孙德全，申忠宝，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37