基因组编辑系统及其用途技术方案

本发明专利技术提供了一种基因组编辑系统及其用途，包括a)和b)：a)所述嵌合序列；b)Cas9蛋白。本发明专利技术将靶点和sgRNA与Cas9蛋白整合在一个表达盒中，并使用II型启动子驱动表达，不仅拓宽了sgRNA可利用的启动子范围，有利于实现特异组织的基因编辑，同时消除了对于靶点第一位碱基的限制，扩大了靶点选择范围，而且可以减少载体构建过程中表达盒的数量、简化载体，还能避免由于多个表达盒使用相同的启动子而发生重组导致部分元件的丢失的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因组编辑系统及其用途，特别涉及一种通过II型启动子驱动的CRISPR/Cas9系统及其用途。
技术介绍
CRISPR是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。涉及Cas9蛋白和sgRNA的Ⅱ型CRISPR/Cas系统是代表性的，在sgRNA的引导下，Cas9蛋白首先与sgRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，利用细胞自身的非同源性末端接合和同源重组修复机制实现错误修复或者引入改变，造成DNA序列改变，从而实现基因的定向修饰操作。在植物中，通常使用的CRISPR/Cas系统包含sgRNA和Cas9两个独立的表达盒，并分别由III型启动子(如水稻U3或U6启动子等)和II型启动子(如花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素蛋白1启动子等)驱动表达。该系统主要存在如下缺陷：(1)sgRNA一般由水稻U3或U6启动子驱动表达，但二者要求转录的第一个碱基分别是A和G，因此其对靶点的选择具有一定的限制。(2)水稻U3和U6启动子均为组成型启动子，无法实现在特异组织中对不同的基因进行编辑。(3)如果Cas9表达盒的启动子与选择性标记(如Hpt或PMI等)表达盒的启动子相同，在某些品种的农杆菌中便容易发生因重组而导致的Cas9元件丢失的现象，导致农杆菌转化后获得的转基因植株基本上没有突变体，进而影响CRISPR/Cas9系统的应用效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因组编辑系统及其用途，有效克服了现有技术中III型启动子对转录起始位点的碱基限制、不能在特异组织中对不同的基因进行编辑、由于重组而导致元件丢失导致无法获得突变体等技术缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供一种嵌合序列，包含sgRNA序列和可剪切序列，所述sgRNA序列插入间插序列的内部。进一步地，所述sgRNA序列插入所述间插序列内部的位置两侧各至少保留长度为12bp的所述间插序列。在上述技术方案的基础上，所述嵌合序列还包括靶点序列。具体地，所述间插序列为内含子序列。为实现上述目的，本专利技术还提供一种基因组编辑系统，包括a)和b)：a)所述嵌合序列；b)Cas9蛋白。进一步地，所述嵌合序列与编码所述Cas9蛋白的核酸序列有效连接。所述嵌合序列有效连接于调控序列。在上述技术方案的基础上，所述调控序列包括II型启动子和/或定位结构域。优选地，所述II型启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。具体地，所述组成型启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素启动子。所述组织特异性启动子包括花粉特异性表达启动子、根特异性表达启动子、绿色组织特异性表达启动子或胚乳特异性表达启动子。所述诱导型启动子包括化学诱导型启动子、冷诱导型启动子、热诱导型启动子或病毒诱导型启动子。为实现上述目的，本专利技术还提供一种由II型启动子驱动的基因组编辑系统，包括a)、b)和c)：a)II型启动子；b)所述嵌合序列；c)Cas9蛋白。进一步地，所述嵌合序列与编码所述Cas9蛋白的核酸序列有效连接。所述嵌合序列有效连接于所述II型启动子。优选地，所述II型启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。具体地，所述组成型启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素启动子。所述组织特异性启动子包括花粉特异性表达启动子、根特异性表达启动子、绿色组织特异性表达启动子或胚乳特异性表达启动子。所述诱导型启动子包括化学诱导型启动子、冷诱导型启动子、热诱导型启动子或病毒诱导型启动子。为实现上述目的，本专利技术还提供一种表达盒，包含编码所述基因组编辑系统的核酸序列或编码所述由II型启动子驱动的基因组编辑系统的核酸序列。为实现上述目的，本专利技术还提供一种重组表达载体，包含编码所述基因组编辑系统的核酸序列或或编码所述由II型启动子驱动的基因组编辑系统的核酸序列或所述表达盒。为实现上述目的，本专利技术还提供一种实现基因组编辑的方法，包括在生物体中表达所述基因组编辑系统或所述由II型启动子驱动的基因组编辑系统。为实现上述目的，本专利技术还提供一种编辑靶位点序列的方法，包括将所述基因组编辑系统导入包含靶位点序列的生物体中。为实现上述目的，本专利技术还提供一种产生基因组编辑的植物的方法，包括向植物基因组中引入编码所述基因组编辑系统的核酸序列或编码所述由II型启动子驱动的基因组编辑系统的核酸序列。为实现上述目的，本专利技术还提供一种产生基因组编辑植物种子的方法，包括将所述方法产生的基因组编辑的植物自交，从而获得具有基因组编辑植物种子。为实现上述目的，本专利技术还提供一种培育基因组编辑植物的方法，包括：种植至少一粒所述方法产生的所述基因组编辑植物种子；使所述种子长成植株。为实现上述目的，本专利技术还提供一种所述基因组编辑系统或所述由II型启动子驱动的基因组编辑系统在获得基因组突变生物中的用途。为实现上述目的，本专利技术还提供一种试剂盒，包括所述基因组编辑系统或所述由II型启动子驱动的基因组编辑系统，用于实现基因组编辑。本专利技术中所述的CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，是指成簇的规律间隔的短回文重复序列，含有多个短同向重复的基因座，其被发现存在于约40％测序细菌的基因组中和90％测序古细菌的基因组中。CRISPR作为原核的免疫系统发挥功能，其赋予对外来遗传元件例如质粒和噬菌体的抵抗性。CRISPR系统提供了一种获得性免疫形式。外源DNA的短片段(称为间隔区)整合在CRISPR重复序列之间的基因组中，然后CRISPR间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于识别和沉默外来遗传元件。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。本专利技术所述Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库登录号Q99ZW2下。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。本专利技术中所述的Cas9，Ⅱ型CRISPR/Cas系统中一种重要本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合序列，其特征在于，包含sgRNA序列和可剪切序列，所述sgRNA序列插入间插序列的内部。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合序列，其特征在于，包含sgRNA序列和可剪切序列，所述sgRNA序列插入间插序列的内部。2.根据权利要求1所述嵌合序列，其特征在于，所述sgRNA序列插入所述间插序列内部的位置两侧各至少保留长度为12bp的所述间插序列。3.根据权利要求1或2所述嵌合序列，其特征在于，所述嵌合序列还包括靶点序列。4.根据权利要求1-3任一项所述嵌合序列，其特征在于，所述间插序列为内含子序列。5.一种基因组编辑系统，其特征在于，其特征在于，包括a)和b)：a)权利要求1-4任一项所述嵌合序列；b)Cas9蛋白。6.根据权利要求5所述基因组编辑系统，其特征在于，所述嵌合序列与编码所述Cas9蛋白的核酸序列有效连接。7.根据权利要求5或6所述基因组编辑系统，其特征在于，所述嵌合序列有效连接于调控序列。8.根据权利要求7所述基因组编辑系统，其特征在于，所述调控序列包括II型启动子和/或定位结构域。9.根据权利要求8所述基因组编辑系统，其特征在于，所述II型启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。10.根据权利要求9所述基因组编辑系统，其特征在于，所述组成型启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素启动子。11.根据权利要求9所述基因组编辑系统，其特征在于，所述组织特异性启动子包括花粉特异性表达启动子、根特异性表达启动子、绿色组织特异性表达启动子或胚乳特异性表达启动子。12.根据权利要求9所述基因组编辑系统，其特征在于，所述诱导型启动子包括化学诱导型启动子、冷诱导型启动子、热诱导型启动子或病毒诱导型启动子。13.一种由II型启动子驱动的基因组编辑系统，其特征在于，包括a)、b)和c)：a)II型启动子；b)权利要求1-4任一项所述嵌合序列；c)Cas9蛋白。14.根据权利要求13所述基因组编辑系统，其特征在于，所述嵌合序列与编码所述Cas9蛋白的核酸序列有效连接。15.根据权利要求13或14所述基因组编辑系统，其特征在于，所述嵌合序列有效连接于所述II型启动子。16.根据权利要求13-15任一项所述基因组编辑系统，其特征在于，所述II型启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。17.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨进孝，徐雯，张成伟，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11