用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法技术方案

本发明专利技术提供了用于复制或扩增来自生物样品的核酸分子的方法、试剂、设备、以及系统。在本发明专利技术的一个实施方案中，将所述核酸分子从所述样品中分离，并且进行片段化并且使用连接剂使一个或多个发夹结构连接到所述片段化的核酸分子的每一个末端以形成一个或多个哑铃状模板。使所述一个或多个哑铃状模板与和基质连接的至少一种基本上互补的引物接触，并且进行滚环复制或滚环扩增。所述所得的复制的哑铃状模板或扩增的哑铃状模板用于许多基因组应用，包括全基因组从头测序；序列变体检测、结构变体检测、确定分子单倍型的相、分子计数以用于非整倍体检测；基因集合、全外显子组、或染色体区的靶向测序以用于序列变体检测、结构变体检测、确定分子单倍型的相和/或分子计数以用于非整倍体检测；研究核酸‑核酸结合相互作用、核酸‑蛋白质结合相互作用、以及核酸分子表达阵列；以及测试小分子抑制剂或激活剂或核酸治疗剂的作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的实施方案大体上涉及核酸分子的复制和扩增的领域。更确切地说，本专利技术的某些实施方案涉及使用滚环复制从生物样品复制DNA分子。本专利技术的其它实施方案涉及使用滚环扩增从生物样品扩增DNA分子。本专利技术的某些实施方案可以用于表征源自于生物样品的基因组中的序列变异。本专利技术的某些实施方案可以用于对源自于生物样品的整个染色体或其部分进行分子计数。本专利技术的某些实施方案可以用于表征源自于生物样品的基因组中的单倍型结构。本专利技术的某些实施方案可以应用于基因组科学、生物医药研究、诊断测定、以及疫苗和治疗剂开发中的样品制备和分析。
技术介绍
全基因组技术，如高密度基因分型阵列和下一代测序(NGS)可以鉴定给定的个体或物种的序列变异，特别是单核苷酸多态性(SNP)和单核苷酸变体(SNV)，这些在本文被统称为“序列变体”。然而，当前的方法不能确定同一个DNA分子上那些序列变体的组合。确定序列变体的组合被称作“定相(phase)”并且同一个DNA分子上序列变体的特定组合被称作“单倍型”。举例来说，人类个体是二倍体的，每一个体细胞含有从每一个亲本遗传而来的两组常染色体。表征给定的个体的单倍型状态对于定位疾病基因、阐明群体病史、以及研究顺式作用变体和反式作用变体在表型表达中的平衡来说是重要的。存在三种确定单倍型信息的一般方法：(i)群体推断；(ii)亲本推断；以及(iii)分子单倍型分析。用于对单倍型进行定相的最常见的方法是使用来自从群体基因型或亲本基因型获得的数据的推断和统计方法。然而，在整个基因组上的单倍型信息不能使用计算方法来分辨，特别是当给定的染色体区域的连锁不平衡较低时以及对于罕见变体来说。另一方面，亲本推断方法依靠在家庭谱系的背景下序列变异的基因遗传的原理。虽然在正确执行时是有效的，但是许多生物样品缺乏足够的谱系信息或需要适当的家族样品来推断所关注的给定样品的单倍型状态。已知多种分子单倍型分析方法克服了基于计算的方法的限制。这些分子方法包括分离单个DNA分子或单个DNA分子的组，然后进行基因分型或测序以确定给定生物样品的单倍型结构的各种策略。一种这样的策略涉及构建大插入序列克隆(即F粘粒(fosmid))文库。然后将这些克隆在多孔板(即96孔板或384孔板)的单个孔中稀释，形成模板文库，进行条形编码以跟踪特定克隆到单个孔，并且通过基因分型或测序方法来表征。对单个染色体或其部分的单倍型进行定相的挑战减少到对微量滴定板内稀释池中更小的DNA片段(即在尺寸上从几百兆碱基到数十千碱基至数百千碱基)进行表征。还已经报道了设定DNA片段的尺寸或使用基因组DNA而不是形成大插入序列克隆，继而是稀释，通过全基因组方法扩增，形成模板文库，并且测序以确定给定的样品的单倍型。还可以通过流式分选方法或显微解剖方法分离整个染色体或其部分，继而稀释，通过全基因组方法扩增，形成模板文库，并且进行基因分型或测序以确定来自生物样品的给定基因组的单倍型结构。所有这些方法均需要高水平的技术专长以及在对给定的生物样品的单倍型进行定相中形成大量的单个模板文库(约数百个)。大多数的成像系统不能检测单个荧光事件，因此不得不对样品中的DNA分子进行扩增。目前存在三种下一代测序方法：(i)乳液PCR(emPCR)；(ii)固相扩增；以及(iii)基于溶液的滚环复制。对于所有这些方法，通常使用标准物理剪切技术将基因组DNA片段化以形成DNA片段的文库。存在其中可能不需要片段化的例外。举例来说，一些生物来源，如从癌症患者或妊娠的女性获得的血浆或血清含有通常以小于1,000个碱基对(bp)并且在一些情况下小于500bp的尺寸存在的循环无细胞基因组DNA片段。根据是否需要尺寸选择的中间步骤，然后将含有通用引发位点的衔接子序列连接到DNA片段末端。使用共同PCR引物进行有限次数的PCR循环。这三种方法在这一步骤上有区别，但是在所有情况下，这些克隆扩增方法限于复制或扩增在尺寸上通常小于1,000bp的小片段，并且在更典型的实例中，限于700bp或更小。举例来说，Illumina的固相扩增方法最多仅可以扩增具有700bp的尺寸的DNA片段。这一尺寸限制制约了从头组装人类基因组的能力。当前的全基因组技术，特别是NGS的显著缺点在于依赖于源自于短模板文库的序列读段，这些序列读段然后以大规模并行形式被克隆扩增。重要的是，当前的配对末端文库构建方法在本质上会破坏容易地鉴定出在正常人类基因组中存在的并且似乎在许多疾病的产生中特别重要的大的复杂的结构改变的能力。基因组结构变异可以代表早期肿瘤发生和癌症进展、疾病易感性、以及治疗抗性中的驱动力。源自于短模板文库的序列读段使得非常难以经由从头组装来完全分辨新型的、重复的以及疾病改变的序列。因而，大多数的全基因组测序工作仍依靠于将序列读段与参考基因组进行比对。因此，NGS数据集可能含有仍未表征的大段的人类基因组序列，并且对疾病机制的了解可能因缺乏基因组结构信息而有偏差。大多数的全基因组测序工作仍依赖于将序列读段与参考基因组进行比对。虽然比对实验可以捕捉大部分的序列变体，但是需要约10kb至100kb的大模板来分辨大部分的结构变体和/或提供在整个人类基因组上单倍型的定相。许多分子生物学和计算机软件技术已经被用于克服尺寸限制。尽管获得了一定的改进，但是缺点是生物学工作流程的复杂性以及与试剂、劳动力、以及计算机硬件相关的成本显著增加。通过将线性核酸片段的末端连接而形成DNA环是一种非常低效的方法，这需要显著量的来自生物样品的起始物质。与通过使给定的DNA片段的远端彼此靠近而形成环相关的问题从20世纪80年代起就已经是本领域公认的。举例来说，与通过使DNA片段的末端连接在一起以形成环相关的一个问题是“分子内”连接事件(即同一个DNA片段的DNA环)与“分子间”连接事件(即被称作多联体的两个或更多个DNA片段的连接)之间的竞争反应。与通过将DNA片段的末端连接在一起以形成环相关的另一个问题是相较于更小的DNA片段，必须将更大的DNA片段进一步稀释以达到形成分子内环的合理的效率。本领域需要将形成大DNA环(即用于桑格测序(Sangersequencing)的5kb至7kb或更大的大插入序列克隆)与下一代测序方法的高通量复制或扩增性质相结合的创新方法。本专利技术的某些实施方案通过以非尺寸依赖性方式形成DNA环而克服了从大DNA片段形成DNA环的尺寸限制。本专利技术的其它实施方案通过掺入非尺寸依赖性DNA环，通过形成和复制或扩增可用于许多基因组科学应用的大插入序列模板来克服直接扩增>1千碱基的模板的尺寸限制。本专利技术还通过提供更简单的使用哑铃状环制备大插入序列模板的工作流程以及改良的用于滚环复制和滚环扩增以形成用于测序应用的多个拷贝的方法来克服当前方法的研究人员工作的复杂性和相关的更高的成本。本专利技术的某些实施方案还通过提供更简单的用于制备依赖于通用引物序列的模板的工作流程来克服需要单独的等位基因鉴别引物以用于一组不同的异源核酸序列的基因分型和测序应用的限制。
技术实现思路
本专利技术的一个实施方案是一种复制至少一个DNA分子的方法。所述方法包括以下步骤：将至少一个DNA分子片段化以形成至少一个片段化的DNA分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复制至少一个核酸分子的方法，所述方法包括：将至少一个核酸分子片段化以形成至少一个片段化的核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少一种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；以及在与所述至少一种基本上互补的引物接触的所述至少一个哑铃状模板上进行滚环复制以形成至少一个复制的哑铃状模板。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.11 US 61/978,8231.一种复制至少一个核酸分子的方法，所述方法包括：将至少一个核酸分子片段化以形成至少一个片段化的核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少一种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；以及在与所述至少一种基本上互补的引物接触的所述至少一个哑铃状模板上进行滚环复制以形成至少一个复制的哑铃状模板。2.一种检测至少一个复制的哑铃状模板的方法，所述方法包括：将至少一个核酸分子片段化以形成至少一个片段化的核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少一种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；在与所述至少一种基本上互补的引物接触的所述至少一个哑铃状模板上进行滚环复制以形成至少一个复制的哑铃状模板；以及检测所述至少一个复制的哑铃状模板。3.如权利要求2所述的方法，其中检测所述至少一个复制的哑铃状模板的步骤由对所述至少一个复制的哑铃状模板进行测序组成。4.如权利要求1所述的方法，其中检测所述至少一个复制的哑铃状模板的步骤包括使所述至少一个复制的哑铃状模板与DNA探针接触。5.如权利要求4所述的方法，其中所述DNA探针与荧光团连接。6.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：从样品中分离至少一个核酸分子；将至少一个核酸分子片段化以形成至少一个片段化的核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少一种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；以及在与所述至少一种基本上互补的引物接触的所述至少一个哑铃状模板上进行滚环复制以形成至少一个复制的哑铃状模板。7.一种复制至少一个核酸分子的方法，所述方法包括：从样品中分离至少一个核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少一种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；以及在与所述至少一种基本上互补的引物接触的所述至少一个哑铃状模板上进行滚环复制以形成至少一个复制的哑铃状模板。8.一种用于检测至少一个核酸分子的序列的哑铃状模板，其中所述哑铃状模板是通过包括以下的方法制备的：从样品中分离至少一个核酸分子；以及使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板，其中所述哑铃状模板是至少约20千碱基长。9.一种用于检测至少一个核酸分子的序列的哑铃状模板，其中所述哑铃状模板是通过包括以下的方法制备的：从样品中分离至少一个核酸分子；以及使两个或更多个不同的发夹结构连接到所述至少一个核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板。10.一种扩增至少一个核酸分子的方法，所述方法包括：将至少一个核酸分子片段化以形成至少一个片段化的核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少一种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；以及在与所述至少一种基本上互补的引物接触的所述至少一个哑铃状模板上进行滚环扩增以形成至少一个扩增的哑铃状模板。11.一种检测至少一个扩增的哑铃状模板的方法，所述方法包括：将至少一个核酸分子片段化以形成至少一个片段化的核酸分子；使一个或多个发夹结构连接到所述至少一个片段化的核酸分子的每一个末端以形成至少一个哑铃状模板；使所述至少一个哑铃状模板与至少两种基本上互补的引物接触，其中所述至少一种基本上互补的引物与至少一种基质连接；在与所述至少一种基本上互补的引物接触的至少一个哑铃状模板上进行滚环扩增以形成至少一个扩增的哑铃状模板；以及检测所述至少一个扩增的哑铃状模板。12.如权利要求11所述的方法，其中检测所述至少一个扩增的哑铃...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·L·梅兹可，C·A·威尔，
申请(专利权)人：雷德沃特生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US