无核酸酶的基因组编辑制造技术

提供了用于编辑细胞基因组而不使用外源提供的核酸酶的方法和组合物。该方法的方面包括将细胞与包含待整合到目标基因座中的核酸序列的靶向载体接触，其中该细胞不与核酸酶接触。另外，提供了发现用于实施所述方法的试剂、装置和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉参考本申请要求2014年9月3日提交的美国临时专利申请号62/045,451、2014年8月29日提交的美国临时专利申请号62/044,145、2014年3月24日提交的美国临时专利申请号61/969,709、2014年3月21日提交的美国临时专利申请号61/969,013的优先权，各申请通过引用全文纳入本文。政府权利本专利技术是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的合同HL064274下于政府资助下完成。政府对本专利技术享有某些权利。专利
本专利技术涉及没有外源性核酸酶的基因组编辑。专利技术背景基因组的位点特异性操作是医学、生物技术和生物学研究中许多应用的理想目标。近年来，已经进行了许多努力来开发用于体内和体外在有丝分裂和有丝分裂后细胞中进行基因靶向的位点特异性核酸酶。然而，这些靶向的核酸酶通常对细胞有毒并且它们的脱靶活性可能是免疫原性和基因毒性的。本领域需要编辑细胞基因组而不使用外源提供的核酸酶的方法。本专利技术解决了这些问题。
技术实现思路
提供了用于编辑细胞基因组而不使用外源提供的核酸酶的方法和组合物。该方法的方面包括将细胞与包含待整合到目标基因座中的核酸序列的靶向载体接触，其中该细胞不与核酸酶接触。另外，提供了发现用于实施所述方法的试剂、装置和试剂盒。附图的简要说明结合附图，通过以下详述更好地理解本专利技术。需要强调，按照惯例，附图的各个特征不成比例。相反，各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图部分包括如下的附图。图1.载体设计和靶向方案：密码子优化的人F-IXcDNA(浅绿)之前是编码2A肽的序列(P2A，深绿)。其侧接与从5’(蓝色)和3’(UTR，黄色)跨白蛋白终止密码子的序列同源的那些序列。同源臂分别长1.3和1.4Kb。整合到Alb基因座产生嵌合基因。然而，由2A肽诱导的核糖体跳跃产生2种分开的蛋白质。白蛋白留有21个氨基酸长的2A标签，而凝血因子连接至N端脯氨酸，其之后在ER中经处理作为信号肽的部分。图2.用含通过点印迹滴定的2.5e11载体颗粒的50μl腹膜内(IP)注射入2天龄的C57BL/6J(B6)小鼠。从生命的第4周开始，每周通过ELISA评价血浆hF-IX，之后进行眼球后血液收集。N＝6，误差线代表标准差。图3.用含通过点印迹滴定的1e12载体颗粒的100μl静脉内(IV)注射成年C57BL/6J(B6)小鼠。从生命的第4周开始，每周通过ELISA评价血浆hF-IX，之后进行眼球后血液收集。N＝3，误差线代表标准差。图4.RT无偏PCR显示hF-IX从靶上整合开始表达。用引物RT(上)进行逆转录，之后是用随机引物进行第二链DNA合成，用MseI限制性酶切割，接头连接并且用引物对1和2进行PCR。蓝色：Alb外显子，橙色：Alb内含子，黑实现：载体和基因组之间同源性的终点。对PCR产物(下)进行测序并且发现对应于融合的白蛋白_F-IX转录本，如从靶上整合中所预期的那样。无偏方法没有产生对应于附加体表达或脱靶整合的PCR产物。图5.显示白蛋白大小的单一抗-2A条带的血浆Western印迹分析表明仅有靶上表达。图6.对肝的Western印迹分析。hF-IX条带的大小表示2A肽的高效核糖体跳跃。图7.F-IX敲除小鼠中的表型校正(B6和CD-1杂交)。用1x10^12个AAV8_hF-IX的载体基因(Vg)注射成年小鼠。在注射后2周通过aPTT试验来测量凝结时间。用AAV8_hF-IX靶向载体注射的小鼠显示显著改善的凝结时间。图8.载体设计和实验方案。A.rAAV8载体编码密码子优化的侧接同源臂的hF9cDNA和在前2A-肽编码序列，该同源臂指导向Alb终止密码子的5’整合。5’和3’臂的长度分别是1.3和1.4-kb。在通过同源重组整合后，Alb和hF9在DNA和RNA水平上融合，但是由于核糖体跳跃而产生2种分离的蛋白质。B.关于Alb同源臂，AAV反向控制具有与2A-肽编码序列、相邻的Alb外显子和在前剪接点一起反转的hF9。细白色矩形：Alb内含子；粗灰色矩形：Alb外显子；粗白色矩形：P2A；粗白色箭头：hF9；粗浅灰色矩形：基因外DNA；虚线：终止密码子；椭圆：反转的末端重复；P＝脯氨酸。图9.注射的小鼠中，人因子IX表达和活性。A.在用2.5e11vg的hF9实验构建体(n＝6)或反转对照(n＝3)IP注射的2天龄B6小鼠后通过ELISA测量的血浆hF9。检测限之下的测量值被分配为20ng/mL的阈值。PH＝部分肝切除。误差线代表标准差。虚线表示正常F9水平的5％和20％。B.在用1e12vg的AAVhF9实验构建体(n＝7)，或反转对照(n＝3)尾静脉注射，或者用30μg编码“正确”取向的hF9构建体的质粒(3.5e12拷贝数)高压注射入9周龄B6小鼠后通过ELISA测量的血浆hF9。检测限为20ng/mL。误差线和虚线同(A)。C.在用命名为MOI的AAVhF9实验构建体尾静脉注射入9周龄B6小鼠后通过ELISA测量的血浆hF9(每组n＝4)。误差线代表标准差。D.在每只小鼠尾静脉注射1e12AAV8-hF9vg的2周后通过活化的部分血栓栓塞时间(aPPT)测量凝结效率(n＝5)。误差线代表标准差。E.对来自用AAV8-hF9构建体或反转对照注射的小鼠的肝脏样品中hF9的Western印迹分析。hF9的预期大小是55-Kd。图10.在DNA和RNA水平上的Alb靶向率。A.从使用与基因组基因座而不是载体退火的生物素化引物1(黑色)的显性扩增(LAM)开始的靶上整合率评价。然后显性扩增子结合至链霉亲和素化的珠并洗涤以排除附加体载体。用随机引物的后续第二链DNA合成，之后是CviQI限制性消化。然后连接相容的接头，之后是两轮巢式PCR(蓝色的引物2-3，然后红色的引物4-5)。CviQI在靶向和野生型等位基因中距离同源边界相同距离处切割，因此允许无偏扩增。第二次巢式PCR的扩增子然后用作使用引物6-7(绿色)或8-9(橙色)的qPCR试验的模板。B.对于mRNA定量，使用引物10-11或11-12来生成用于qPCR试验的cDNA。形状和填写代码与图1相同。C.黑色柱表示Alb等位基因的靶向率，即由引物6-7扩增的DNA模板的丰度与由引物8-9扩增的DNA模板的丰度之比，由0.7的系数校正以考虑肝实质细胞频率。灰色柱表示靶向的Alb等位基因的表达率，即由引物10-11扩增的cDNA模板的丰度与由引物11-12扩增的cDNA模板的丰度之比。各组N＝3，而误差线代表标准偏差。图11.hF9表达的特异性。A.用聚-dT引物从RT产生的cDNA用作使用引物13-14或14-15的qPCR试验的模板。B.柱表示Alb_hF9mRNA与总含hF9的mRNA的比率，即由引物13-14扩增的cDNA模板的丰度与由引物14-15扩增的cDNA模板的丰度之比。各组N＝3，而误差线代表标准偏差。C.用针对P2A的探针对肝脏样品的Northern印迹分析。较低的非特异性信号对应于18SrRNA的大小。D.对来自用AAV-P2A-hF9构建体或反转对照注射的小鼠的肝脏样品中P2A的Western印迹分析。P2A预期与白蛋白(66.5-K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在没有外源提供的核酸酶的情况下将转基因靶向整合到细胞的基因组中的方法，所述方法包括：使细胞与重组病毒载体接触，所述重组病毒载体包含：i.包含第一核酸序列和第二核酸序列的多核苷酸，其中所述第一核酸序列编码所述转基因；并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5’或3’方向上并在整合到细胞基因组中的靶整合位点中后促进产生2种独立的基因产物；ii.第三核酸序列，其位于所述多核苷酸的5’方向上并包含与细胞基因组中靶整合位点的5’基因组序列基本同源的序列；和iii.第四核酸序列，其位于所述多核苷酸的3’方向上并包含与细胞基因组中靶整合位点的3’基因组序列基本同源的序列；其中所述细胞不与核酸酶或编码核酸酶的核酸接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.21 US 61/969,013;2014.03.24 US 61/969,709;1.一种在没有外源提供的核酸酶的情况下将转基因靶向整合到细胞的基因组中的方法，所述方法包括：使细胞与重组病毒载体接触，所述重组病毒载体包含：i.包含第一核酸序列和第二核酸序列的多核苷酸，其中所述第一核酸序列编码所述转基因；并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5’或3’方向上并在整合到细胞基因组中的靶整合位点中后促进产生2种独立的基因产物；ii.第三核酸序列，其位于所述多核苷酸的5’方向上并包含与细胞基因组中靶整合位点的5’基因组序列基本同源的序列；和iii.第四核酸序列，其位于所述多核苷酸的3’方向上并包含与细胞基因组中靶整合位点的3’基因组序列基本同源的序列；其中所述细胞不与核酸酶或编码核酸酶的核酸接触。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是非分裂细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触发生在体内。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法发现用于治疗与遗传缺陷相关的医学病症。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述医学病症选自：血友病、A型血友病、B型血友病、支链有机酸尿症、槭树糖浆尿病(MSUD)、异戊酸血症(IVA)、丙酸尿症(PA)、甲基丙二酸尿症(MMA)、3-甲基巴豆酰甘氨酸尿症、I型3-甲基戊烯二酸尿症、短/支链乙酰-CoA脱氢酶缺乏、2-甲基-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶缺乏、异丁酰基-CoA脱氢酶缺乏、3-羟基异丁酸尿症、丙二酸尿症、长链脂肪酸氧化疾病、糖原贮积病、I型糖原贮积病(GSD1)、肉碱循环障碍、尿素循环障碍、克里格勒-纳贾尔综合征、遗传性酪氨酸血症、大疱性表皮松解症、肝豆状核变性、腺苷脱氨酶缺乏、镰状细胞疾病、X连锁重症联合免疫缺陷(SCID-X1)、地中海贫血、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏、戴-布二氏贫血、高雪氏病、生长激素缺乏、和帕金森病。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法发现用于促进免疫预防。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转基因编码促进免疫预防的试剂。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述促进免疫预防的试剂是抗体或嵌合多肽，并且针对选自下组的病原体有特异性：人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、真菌、和细菌。9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法发现用于促进伤口愈合。10.一种用于将转基因整合到细胞的基因组中的靶整合位点的重组病毒载体，所述载体包含：包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·巴泽尔，M·A·凯，
申请(专利权)人：小利兰·斯坦福大学托管委员会，
类型：发明
国别省市：美国;US