本发明专利技术提供具有至少两种阳离子脂质以及一种或任选地超过一种非阳离子脂质的脂质聚集体组合物，其用于将包括核酸，尤其DNA和RNA以及蛋白质的生物活性分子活体外和/或活体内递送到细胞和组织中。还提供使用本发明专利技术化合物将生物活性分子递送到细胞和组织中以促进其中靶蛋白表达的方法。在一些非限制性实施例中，本发明专利技术脂质聚集体组合物可用于递送核酸分子以促进涉及细胞重编程和基因组编辑应用的蛋白质的表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2014年7月15日提交的美国临时申请第62/024,918号(与本申请属于同一申请人)的根据35U.S.C.§119(e)的优先权，且其全部内容在此以引用的方式明确地并入，如同在本文中做了完全阐述那样。
本专利技术涉及具有至少两种阳离子脂质且具有与生物活性核酸分子，尤其RNA分子形成复合物的效用的脂质聚集体，其用于改进其递送到广泛多种细胞和组织中。以引用的方式并入本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如每个单独的公开、专利或专利申请经特定且单独地指示以引用的方式并入一般。
技术介绍
已经发现脂质聚集体(如脂质体)适用作在实验室和临床研究环境中将大分子(如DNA、RNA、蛋白质)和小化合物(如小分子或医药学上活性分子)引入到细胞和组织中的递送剂。确切地说，已经展示包含阳离子脂质组分的脂质聚集体对于向细胞递送阴离子分子来说尤其有效。在某种程度上，认为阳离子脂质和用阳离子脂质形成的带正电荷复合物的有效性是由于对细胞亲和力增强，所述细胞中的许多携有净负电荷。另外在某种程度上，包含阳离子脂质的脂质聚集体上的净正电荷使得聚集体能够结合聚阴离子，如核酸。已知，含有DNA和RNA的脂质聚集体是用于靶细胞高效转染的有效药剂。近来年已对基于信使RNA(mRNA)的基因递送产生许多兴趣。mRNA转染具有若干优点，质体或基于载体的转染方法，包括对进入细胞核无要求，其尤其在非分裂细胞中对质体DNA(pDNA)递送造成显著障碍。mRNA还具有整合到宿主基因组中的可忽略的可能性。在癌症免疫疗法和基于干细胞的研究的领域中(作为pDNA的替代物)，(mRNA)常常应用为基因递送分子。另外，已显现对使用mRNA代替pDNA(针对iPS细胞重编程、基因组编辑(CRISPR、TALEN)以及疫苗研发)的兴趣快速增长。尽管存在mRNA转染优于DNA的优点，存在可有效地且不断地产生优于广泛多种细胞类型和谱系(如原代细胞、神经元细胞、血细胞、干细胞)的货物mRNA的较高转染效率且转染细胞系困难的极少可商购试剂。因此，需要能够将多种货物递送到细胞谱系的较宽谱且转染细胞较困难的脂质聚集体调配物。附图说明本专利技术的新颖特征在所附权利要求书中细致阐述。将参考阐述其中利用本专利技术原理的说明性实施例和其附图的以下详细描述来获得对本专利技术特征和优势的更佳理解：图1显示当与基于可商购阳离子脂质的转染试剂2000(LF2K)相比较时，根据一个实施例的脂质聚集体的转染效率改进；图2显示当与使用2000的基于DNA的基因编辑系统相比较时，使用具有用于用本文所描述的脂质聚集体进行基因编辑的指导RNA的Cas9的基于mRNA形式的结果。
技术实现思路
为了提供对本专利技术的更透彻理解，以下描述阐述许多特定细节，例如特定配置、参数、实例等。然而，应认识到，此类描述不意图作为对本专利技术的范围的限制，而是意图提供示例性实施例的更好描述。本专利技术提供用以将靶分子递送到细胞或组织的脂质聚集体的新颖调配物和其使用方法。本专利技术包括第一阳离子脂质和至少一种具有一种或多种额外阳离子脂质的第二阳离子脂质，当用至少一种中性脂质，任选地用第二中性脂质调配时，其为阳离子脂质聚集体，如脂质体的部分。确切地说，形成本专利技术基础的脂质聚集体适用于与一种或多种特定靶分子形成阳离子复合物，所述复合物可接着用于将靶分子活体外(或在一些实施例中活体内)递送到经培养的细胞或组织。定义：在随后的描述中，广泛地利用多个用于细胞培养和重组DNA技术的术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括欲给出所述术语的范围)清楚且更一致的理解，提供以下定义。术语将大分子或化合物“引入”到培养物中是指将大分子或化合物供应到培养基中。这还可被称作使大分子与培养物、细胞或组织“接触”，如将所属领域普通技术人员显而易见。术语将大分子、货物、生物相关分子、化合物等等“引入”到至少一种细胞中是指向细胞提供大分子、货物、生物相关分子、化合物等等以使得大分子、货物或化合物在细胞中内化。举例来说，大分子或化合物可使用转染、转化、注射和/或脂质体引入来引入到细胞中，且还可以使用所属领域的普通技术人员已知的其它方法来引入到细胞中。优选地，在本文所描述的实施例的情况下，通过脂质体引入将大分子或化合物引入到细胞中。大分子优选地是蛋白质、多肽或核酸。在一些优选实施例中，大分子还可以是核酸，如DNA分子或RNA分子。当在本文中在如借助于转染将货物递送到细胞内部中的情况下使用时，术语“货物”一般是指在实验室中的培养物中或在动物或人类中的组织中输送到细胞内部的任何物质，如其在治疗模态中的用途。取决于应用，货物可以是大分子，如核酸(DNA或RNA)、蛋白质或肽，或可以是药物或其它有机小分子。如本文所使用，术语“大分子”涵盖生物分子。在一个实施例中，术语大分子是指核酸。在一个优选实施例中，术语大分子是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在一些实施例中，术语大分子是指DNA。在某些优选但非限制性的实施例中，术语大分子是指RNA分子，一般是使用重组DNA技术合成的大分子。在一些实施例中，下文所描述的根据本专利技术使用的RNA分子可包括至少一种，任选地超过一种，至少两种，任选地超过两种，至少三种，任选地超过三种，至少四种，任选地超过四种，或至少五种可表达的核酸序列，包括可操作地连接于由可表达的核酸序列转译其所需要的一种或多种核酸序列的至少一种开放阅读框架。RNA分子可以是任何类型的RNA分子，包括(但不限于)与将递送到细胞内部的所属领域的技术人员熟悉的基因组编辑系统、核糖核酸酶或任何其它类型或物种的RNA分子(但不限于其)结合使用的mRNA、siRNA、miRNA、反义RNA、指导RNA(gRNA)。本文中使用的术语“转染”意指将核酸、蛋白质或其它货物或大分子递送到培养物中的靶细胞或组织，以使得核酸、蛋白质、货物或其它大分子递送到组织的细胞或构成细胞内部，目的为改变其至少一种生物学功能。如本文所使用的术语“可表达的核酸”与分子量无关地包括DNA和RNA两者，且术语“表达”意味着细胞内核酸的功能性存在的任何表现，包括(但不限于)瞬时表达和稳定表达两者。如本文所使用的术语“细胞”是指包括所有类型的真核和原核细胞。在优选实施例中，所述术语是指真核细胞，尤其培养物中生长的细胞，或在动物或人类组织中发现的细胞。在优选实施例中，细胞是指哺乳动物细胞。在某些示例性但非限制性的实施例中，术语“细胞”意欲指在研究和临床环境中常规使用的任何细胞和细胞系，且可以包括(但不限于)永生化细胞系、经过转化的细胞系或原代细胞。当在转染程序和试剂的情况下使用时，短语“转染困难”或其变体一般是指当使用标准可商购转染试剂(如阳离子脂质)转染时典型地展现小于60％转染效率的任何细胞或细胞系。定义为转染困难的细胞包括原代细胞，如干细胞(包括胚胎干细胞和诱导的多能干细胞)、祖细胞、神经元细胞和衍生自神经组织、原代血细胞(“PBMC”)、HUVEC等的其它细胞类型以及在所属领域中识别为使用可商购转染试剂有效地转染困难(尽管确定)的某些细胞系。转染困难细胞系的实例尤其包括(但不限于)PC12、HepG2、3T3、LNCaP、A549、Jurkat和PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脂质聚集体，其包含第一阳离子脂质和至少一种第二阳离子脂质、第一中性脂质以及任选地第二中性脂质，其中所述脂质聚集体适用于在水性条件下与核酸形成阳离子复合物，其中所述第一和第二阳离子脂质彼此不同，且其中所述第一和第二阳离子脂质中的每一种具有以下结构：和其盐；其中：R1和R2独立地是具有8到30个碳原子的烷基、烯基或炔基；具有8到30个碳原子且任选地经醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代的烷基、烯基或炔基，或其中R1是‑(CH2)q‑N(R6)tR7R8；R3和R4独立地是氢，或具有8到30个碳原子且任选地经醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代的烷基、烯基或炔基；R5‑R8独立地是氢，或烷基、烯基或炔基；R9是氢，或烷基、烯基或炔基，碳水化合物或肽；r、s和t是1或0以指示所指定的R基团存在或不存在，当r、s或t中的任一个是1时，所指定的R基团所连接的氮带正电荷，且其中r、s或t中的至少一个是1；q是介于1到6范围内的整数(包括端点)；Xv—是阴离子，其中v是阴离子的价数且A是阴离子的数目；L是能够共价连接两个氮的二价有机自由基，选自：(CH2)n，其中n是介于1到10范围内的整数(包括端点)，其任选地经一个或多个ZR10基团取代，其中Z是O或S，且R10是氢或烷基、烯基或炔基；或{‑(CH2)k‑Y‑(CH2)m}p‑，其中k和m独立地是介于1到10范围内的整数(包括端点)，且p是介于1到6范围内的整数(包括端点)，且Y是O、S、CO、COO、CONR11、NR11CO或NR11COR11N，其中R11与任何其它R11独立地是氢或烷基；其中R1‑R10的烷基、烯基或炔基的一个或多个CH2基团可以经O、S、S‑S、CO、COO、NR12CO、NR12COO或NR12CONR12替换，其中R12与任何其它R12独立地是氢或烷基、烯基或炔基；且其中R1‑R12的烷基、烯基或炔基任选地经一个或多个OR13、CN、卤素、N(R13)2、肽或碳水化合物基团取代，其中R13与其它R13独立地是氢或烷基、烯基或炔基，且其中当以烷基形式存在时，R3和R4中的至少一个经OR13和N(R13)2基团两者取代。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.15 US 62/024,9181.一种脂质聚集体，其包含第一阳离子脂质和至少一种第二阳离子脂质、第一中性脂质以及任选地第二中性脂质，其中所述脂质聚集体适用于在水性条件下与核酸形成阳离子复合物，其中所述第一和第二阳离子脂质彼此不同，且其中所述第一和第二阳离子脂质中的每一种具有以下结构：和其盐；其中：R1和R2独立地是具有8到30个碳原子的烷基、烯基或炔基；具有8到30个碳原子且任选地经醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代的烷基、烯基或炔基，或其中R1是-(CH2)q-N(R6)tR7R8；R3和R4独立地是氢，或具有8到30个碳原子且任选地经醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：X·德默勒拉特杜居，N·安卓恩尼寇，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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