【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、适应性免疫应答由t细胞受体(tcr)识别由主要组织相容性分子(pmhc)呈递的肽而引发。tcr与激动剂pmhc的接合导致基于cd3免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的磷酸化，启动下游信号传导的级联，其导致t细胞激活。尽管tcr-pmhc相互作用的3d亲和力(kd1-100mm)低，但t细胞响应的效力已经被证明通常反映了特定相互作用的强度或持续时间。
2、tcr信号传导会受到除tcr对pmhc的亲和力以外的参数的影响。例如，力依赖性相互作用是激动剂pmhc配体的特征。tcr与激动剂配体形成捕获键(catch bond)，在此期间，相互作用的键寿命(bond lifetime)在力的作用下延长。捕获键代表了在力的作用下分子相互作用的净增益，揭示了内置作为连接tcr识别和随后激活的校对机制的额外水平的动态多样性。这提供了一种触发机制，通过该触发机制，tcr连接和激活可以偶联或去偶联，以调节tcr配体的区分。
3、对肿瘤抗原具有工程改造的特异性的t淋巴细胞的过继转移是一种靶向癌症的有希望的方法，在接受此类治疗的患者中具有有效的抗肿瘤活性。然而，由于大多数肿瘤抗原来源于自身蛋白，因此很难分离出天然的高亲和力肿瘤特异性t细胞，并且必须通过离体工程改造来增强受体序列。
4、然而，重要的是，虽然已经报道了tcr抗原亲和力的显著增加，甚至到皮摩尔范围的程度，但这种水平的亲和力可能增加治疗诱导毒性的风险。在一些情况下，毒性与“靶向(on target)”反应性有关，其中靶抗原在正常细胞(例如表达
5、亲和力成熟还增加了tcr会与癌细胞外的组织上的其他肽-mhc分子交叉反应的可能性，导致脱靶(off target)毒性和可能的患者不良事件或死亡。通过靶向人类肿瘤抗原mage-a3的亲和力成熟的tcr已经证明了这一点；这些tcr-t细胞与称为肌联蛋白(titin)的心脏肽发生交叉反应，对患者产生致命后果。
6、该问题是所有tcr-t疗法的先天限制，因为tcr通常具有低亲和力，并且不会杀死表达自身抗原的细胞如在肿瘤上表达的细胞。本公开提供了解决这一问题的筛选方法和有用的tcr序列。
技术实现思路
1、提供了工程改造的t细胞受体(tcr)序列、表达此类序列的细胞及其使用方法。工程改造的受体在体外被诱变，并且结合pmhc亲和力的选择进行靶激活效力的选择，所述pmhc亲和力足够低以降低脱靶交叉反应性。pmhc亲合力被包含在适当的窗口内；超过这个阈值水平，会损害功效和特异性。在一些实施方案中，表达工程改造的tcr的细胞用于过继性t细胞疗法以治疗癌症。在一些实施方案中，工程改造的tcr识别肿瘤相关抗原(taa)：人mage-a3。在一些实施方案中，taa在人类hla-a1的背景下被识别。
2、在一些实施方案中，对mage-a3具有特异性的工程改造的tcr包含seq id no：1的α链(tcrα)或其缺乏信号序列的成熟版本，并且包含至少一种氨基酸修饰以增强靶激活效力，其中所述修饰在选自d28、a30、i51、q52、s53和s54(相对于成熟蛋白质序列编号)的一个或多个残基处进行。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代选自d28h/n/g/k/s；a30h/s/e/n/g；i51v；q52r/h；s53p；s54y/n/r/e/d/h。在一些实施方案中，tcrα具有选自seq id no：2-seq id no：15的序列，或由其衍生的变体。变体可以包含与seq id no：2-15的参考序列至少约90％的序列同一性、至少约95％的序列同一性、至少约97％的序列同一性、至少约99％的序列同一性。在任何此类实施方案中，β链(tcrβ)可以具有seq id no：16所示的序列或其成熟版本，缺少信号序列。mage-a3工程改造的tcr对人肌联蛋白序列没有显著的亲和力。
3、工程改造的tcr，例如对mage-a3具有特异性的tcr，可以具有约0.5至约100μm的3dlog kd(μm)，并且可以为约1至约100μm，约1至约50μm。期望地对工程改造的tcr靶激活效力进行选择，如通过任何便利的测定所测量的，包括但不限于响应于抗原的t细胞增殖、响应于抗原的il-2的释放、响应于抗原的t细胞上cd69的上调，等等。
4、在一些实施方案中，基于对tcr55α链(seq id no：17)和tcr55β链(seq id no：18)的氨基酸修饰，工程改造的tcr对由hla-b35呈递的hiv肽具有特异性。氨基酸修饰包括但不限于seq id no：17 a98d、a98e、a98f、a98q、a98y、a98h，以使tcr55被b35-hiv激活。tcr55β链(seq id no：18)中的氨基酸修饰包括但不限于a50d、a50e、a50f、a50h、a50n、a50q、a50s、a50t、a50y，以使tcr55被b35-hiv激活。
5、在一些实施方案中，提供了工程改造的细胞，该细胞已经通过引入工程改造的tcr编码序列被修饰，通常通过引入tcrα和tcrβ序列被修饰。任何细胞都可以用于此目的。在一些实施方案中，细胞是t细胞，包括但不限于初始cd8+t细胞、细胞毒性cd8+t细胞、初始cd4+t细胞、辅助t细胞，例如th1、th2、th9、th11、th22、tfh；调节性t细胞，例如tr1、天然treg、诱导型treg；记忆t细胞，例如中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞、nkt细胞、γδt细胞和此类t细胞的工程改造的变体，包括car-t细胞；等等。在其他实施方案中，工程改造的细胞是干细胞，例如造血干细胞、淋巴祖细胞等。在一些实施方案中，在转移到受试者中之前，在离体程序中对细胞进行遗传修饰。工程改造的细胞可以以单位剂量提供用于疗法，并且可以关于预期的接收者是同种异体的、自体的等。编码序列的引入可以在体内或体外，使用任何合适的载体(例如病毒载体、整合载体等)进行。在一些实施方案中，基因编辑系统，包括但不限于crispr-cas9，用于将序列整合到工程改造的细胞的基因组中。
6、在一些实施方案中，提供了一种载体，所述载体包含编码如本文所述的工程改造的tcr序列的多核苷酸序列，其中编码序列可以可操作地连接到在所需的细胞中有活性的启动子。在一些实施方案中，启动子可以是组成型的或诱导型的。各种载体是本领域已知的，并且可以用于此目的，例如病毒载体、质粒载体、微环载体等，这些载体可以被整合到靶细胞基因组中，或者可以游离保持。载体可以在试剂盒中提供。
7、在一些实施方案中，提供了一种治疗方法，该方法包括向有此需要的受体中引入有效剂量的工程改造的细胞群体，其中所述细胞群体已经通过引入编码如本文公开的工程改造的tcr的序列被修饰。细胞群体可以离体进行工程改造，并且对于接受者来说通常是自体的或同种异体的。可以通过施用工程改造的细胞群体来治疗接受者的癌症。接受者可以用工本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对人MAGE-A3具有特异性的工程改造的αβT细胞受体(TCR)，其包含SEQ ID NO：1的α链或其成熟版本，其在选自D28、A30、I51、Q52、S53和S54的一个或多个残基处包含至少一个氨基酸修饰以增强靶激活效力，其中编号是相对于成熟多肽序列进行的。
2.根据权利要求1所述的工程改造的αβTCR，其中MAGE-A3和HLA-A1的3D log KD(μM)为约0.5至约100μM。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程改造的αβTCR，其中所述TCRβ链包含SEQ IDNO：16的序列或其成熟版本。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程改造的αβTCR，其中所述氨基酸修饰为D28H、D28N、D28、D28K、D28S；A30H、A30S、A30E、A30N、A30G；I51V；Q52R、Q52H；S53P；S54Y、S54N、S54R、S54E、S54D、S54H中的一者或多者。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程改造的αβTCR，其中所述TCRα具有选自SEQID NO：2-SEQ ID NO：
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程改造的αβTCR，其中所述TCRa具有与选自SEQID NO：2-SEQ ID NO：15的序列具有至少95％序列同一性的序列。
7.一种对人HLA-B35和HIV肽具有特异性的工程改造的αβT细胞受体(TCR)，其包含SEQID NO：17的α链和SEQ ID NO：18的β链，包含选自SEQ ID NO：17 A98D、A98E、A98F、A98Q、A98Y、A98H和SEQ ID NO：18 A50D、A50E、A50F、A50H、A50N、A50Q、A50S、A50T、A50Y的至少一种氨基酸修饰。
8.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的TCRα或β链。
9.一种载体，其包含根据权利要求8所述的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的载体，其中所述TCR序列可操作地连接至启动子。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的载体，其中所述载体被整合到宿主细胞基因组中。
12.一种工程改造的细胞，其包含根据权利要求8所述的多核苷酸或根据权利要求9至11所述的载体。
13.一种治疗有效剂量的工程改造的细胞群体，其包含根据权利要求所述8的多核苷酸或根据权利要求9至11所述的载体。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的工程改造的细胞或细胞群体，其中所述多核苷酸被整合到所述细胞的基因组中。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的工程改造的细胞或细胞群体，其中所述细胞为T细胞。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的工程改造的细胞或细胞群体，其中所述细胞选自初始CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、辅助T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、天然TReg、诱导型TReg；记忆T细胞，例如中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、γδT细胞。
17.一种治疗表达MAGE-A3的癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效剂量的根据权利要求12至16中任一项所述的工程改造的细胞群体，其中所述工程改造的细胞对癌细胞的杀伤增加。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗与额外的癌症疗法相结合。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
20.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、小细胞肺癌、血液恶性肿瘤、乳腺肿瘤、皮肤肿瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、卵巢肿瘤和肾肿瘤。
21.一种选择与降低的脱靶交叉反应性相结合的靶激活效力的TCR的变体的方法，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种对人mage-a3具有特异性的工程改造的αβt细胞受体(tcr)，其包含seq id no：1的α链或其成熟版本，其在选自d28、a30、i51、q52、s53和s54的一个或多个残基处包含至少一个氨基酸修饰以增强靶激活效力，其中编号是相对于成熟多肽序列进行的。
2.根据权利要求1所述的工程改造的αβtcr，其中mage-a3和hla-a1的3d log kd(μm)为约0.5至约100μm。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程改造的αβtcr，其中所述tcrβ链包含seq idno：16的序列或其成熟版本。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程改造的αβtcr，其中所述氨基酸修饰为d28h、d28n、d28、d28k、d28s；a30h、a30s、a30e、a30n、a30g；i51v；q52r、q52h；s53p；s54y、s54n、s54r、s54e、s54d、s54h中的一者或多者。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程改造的αβtcr，其中所述tcrα具有选自seqid no：2-seq id no：15的序列，或由其衍生的变体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程改造的αβtcr，其中所述tcra具有与选自seqid no：2-seq id no：15的序列具有至少95％序列同一性的序列。
7.一种对人hla-b35和hiv肽具有特异性的工程改造的αβt细胞受体(tcr)，其包含seqid no：17的α链和seq id no：18的β链，包含选自seq id no：17 a98d、a98e、a98f、a98q、a98y、a98h和seq id no：18 a50d、a50e、a50f、a50h、a50n、a50q、a50s、a50t、a50y的至少一种氨基酸修饰。
8.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的tcrα或β链。
9.一种载体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：凯南·克里斯多夫·加西亚，赵祥，
申请(专利权)人：小利兰·斯坦福大学托管委员会，
类型：发明
国别省市：
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