使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法技术方案

本发明专利技术提供了用于对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰的组合物和方法。所述方法和组合物采用向导RNA/Cas内切核酸酶系统来提供有效系统，用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点。本发明专利技术还提供了采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对细胞或生物体的基因组中的核苷酸序列进行基因组修饰、用于编辑基因，和/或用于将目的多核苷酸插入到细胞或生物体的所述基因组中，或使目的多核苷酸从细胞或生物体的所述基因组缺失。一旦鉴定基因组靶位点，便可采用多种方法进一步修饰所述靶位点，使得所述靶位点包含多种目的多核苷酸。本发明专利技术还公开了育种方法和用于利用向导RNA和Cas内切核酸酶这两种成分来选择植物的方法。还提供了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年8月22日提交的美国临时申请61/868706、2013年9月25日提交的美国临时申请61/882532、2014年2月7日提交的美国临时申请61/937045、2014年3月14日提交的美国临时申请61/953090和2014年7月11日提交的美国临时申请62/023239的权益，所有申请据此全文以引用方式并入本文中。
本公开涉及植物分子生物学领域，具体地讲，涉及用于改变植物细胞的基因组的方法。以电子方式提交的序列表参考通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为“20140814_BB2284PCT_ST25_SequenceListing”，创建日期为2014年8月14日，文件大小为560千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术介绍
重组DNA技术已经使其能够将外来DNA序列插入到生物体的基因组中，因此改变生物体的表型。最常使用的植物转化方法是农杆菌(Agrobacterium)感染和粒子枪轰击(biolistic particle bombardment)，其中转基因以随机方式并以不可预测的拷贝数整合到植物基因组中。因此，已经对控制植物中的转基因整合作出了努力。一种用于插入或者修饰DNA序列的方法涉及通过引入侧接有与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。美国专利5,527,695描述了用靶向真核生物DNA的预定序列的DNA序列转化真核生物细胞。具体地讲，讨论了使用位点特异性重组。转化的细胞通过使用选择性标记来鉴定，该选择性标记作为所引入的DNA序列的一部分而被包括。已证实，在植物细胞中人工诱导的位点特异性基因组双链断裂通过使用两个不同的途径用外源供应的DNA进行同源重组而得到修复。(Puchta等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5055-5060；2005年8月4日公布的美国专利申请公布2005/0172365A1；2006年12月14日公布的美国专利申请公布2006/0282914；2005年6月2日公布的WO 2005/028942)。由于DNA区段(包括编码序列和非编码序列在内)的分离、克隆、转移和重组用限制性内切核酸酶进行最便利，许多研究集中在研究和设计内切核酸酶，诸如2004年8月12日公布的WO 2004/067736；1998年8月11日授予Dujon等人的美国专利5,792,632；2003年8月26日授予Dujon等人的美国专利6,610,545 B2；Chevalier等人，(2002)Mol Cell 10：895-905；Chevalier等人，(2001)Nucleic Acids Res 29：3757-3774；Seligman等人，(2002)Nucleic Acids Res 30：3870-3879。虽然已开发了若干种方法来靶向特定位点以用于植物基因组中的修饰，但仍然需要用于产生具有改变基因组的能育植物的更高效和有效的方法，所述改变基因组在植物基因组的限定区域中包含特异性修饰。
技术实现思路
本专利技术提供了在植物中使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，用于选择植物，用于基因编辑，以及用于将目的多核苷酸插入到植物的基因组中。所述方法和组合物采用向导RNA/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。一旦鉴定出基因组靶位点，就可采用多种方法来进一步修饰靶位点，使得它们包含多种目的多核苷酸。还公开了使用双组分向导RNA和Cas内切核酸酶系统的育种方法和用于选择植物的方法。还提供了具有向导RNA/Cas内切核酸酶系统的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷粒。还提供了使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对细胞或生物体的基因组中的靶序列进行基因组修饰，用于基因编辑，以及用于将目的多核苷酸插入到细胞或生物体的基因组中或使其从细胞或生物体的基因组中缺失。所述方法和组合物采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰或改变靶位点以及编辑细胞的基因组内的目的核苷酸序列的有效系统，其中向导多核苷酸由RNA序列、DNA序列或DNA-RNA组合序列组成。因此在本公开的第一实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得包含向导RNA的第二植物，该向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物；c)将(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。在另一个实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。在另一个实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得包含向导RNA和供体DNA的第二植物，其中所述向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；e)选择在所述靶位点处包含插入的目的多核苷酸的子代植物。在另一个实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到所述植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA和供体DNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA，所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物；c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.22 US 61/868706;2013.09.25 US 61/882532;201.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA，所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物；c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。2.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。3.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA和供体DNA，其中所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及e)选择在所述靶位点处包含插入的目的多核苷酸的子代植物。4.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。5.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向具有Cas内切核酸酶的植物细胞提供向导RNA，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。6.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向所述植物细胞提供向导RNA和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。7.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向具有Cas内切核酸酶的植物细胞提供向导RNA和供体DNA，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。8.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括：a)向植物细胞提供向导RNA和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。9.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶DNA序列的方法，所述方法包括：a)向植物细胞提供能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体，以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。10.一种用于将目的多核苷酸引入到植物细胞的基因组中的靶位点中的方法，所述方法包括：a)向植物细胞提供能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体，以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；b)使(a)的所述植物细胞与包含目的多核苷酸的供体DNA接触；以及c)鉴定来自(b)的至少一个植物细胞，所述至少一个细胞在其基因组中包含整合在所述靶位点处的目的多核苷酸。11.根据权利要求5所述的方法，其中所述向导RNA通过粒子轰击直接引入。12.根据权利要求5所述的方法，其中所述向导RNA通过粒子轰击或重组DNA构建体的农杆菌(Agrobacterium)转化而引入，所述重组DNA构建体包含对应的向导DNA，所述向导DNA可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶基因为植物优化的Cas9内切核酸酶。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号以及该Cas密码子区域下游的VirD2核定位信号。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥或红花。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶位点位于乙酰乳酸合酶(ALS)基因、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合酶(ESPSP)基因、雄性能育性(MS45、MS26或MSCA1)基因的基因序列中。19.一种通过根据权利要求5所述的方法制备的植物或种子。20.一种包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在所述基因组靶序列中产生双链断裂。21.一种包含重组DNA构建体和向导RNA的植物，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶和向导RNA能够形成复合物，并在所述植物基因组的基因组靶序列中产生双链断裂。22.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在所述基因组靶序列中产生双链断裂。23.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至表达向导RNA的核苷酸序列的启动子，其中所述向导RNA能够与植物优化的Cas9内切核酸酶形成复合物，并且其中所述复合物能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在所述基因组靶序列中产生双链断裂。24.一种用于选择雄性不育植物的方法，所述方法包括选择在位于雄性能育性基因座中的基因组靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达Cas9内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述基因组靶位点处引入双链断裂。25.一种用于产生雄性不育植物的方法，所述方法包括：a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种Cas内切核酸酶，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在位于所述植物基因组的雄性能育性基因座中的基因组靶位点处引入双链断裂；b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA，所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物；c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及e)选择雄性不育的子代植物。26.根据权利要求24所述的方法，其中所述雄性能育性基因选自MS26、MS45和MSCA1。27.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。29.一种用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将至少一种向导RNA、至少一种多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述核苷酸序列为启动子、调控序列或目的基因。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述目的基因为烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因或乙酰乳酸合酶(ALS)基因。33.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。34.一种用于产生epsps突变植物的方法，所述方法包括：a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物基因组的epsps基因组序列内的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的所述植物细胞获得植物；c)评估(b)的所述植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及d)选择表现出草甘膦耐受性的子代植物。35.一种用于产生epsps突变植物的方法，所述方法包括：a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物基因组的epsps基因组序列内的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的所述植物细胞获得植物；c)评估(b)的所述植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及d)筛选(c)的不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。36.根据权利要求35所述的方法，还包括选择表现出草甘膦抗性的植物。37.一种通过根据权利要求29所述的方法产生的植物、植物细胞或种子。38.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：A西甘，SC法科，H高，Z李，ZB刘，LA赖兹尼克，J史，S斯韦塔舍夫，JK杨，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US