本发明专利技术涉及生产具有高敏感性的重组体内切核酸酶的方法，并且涉及用所述方法获得的内切核酸酶制品，以及其用途，特别是用于检测错配。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鉴定和制备具有高活性和敏感性以及宽底物特异性的错配特异的内切核酸酶。
技术介绍
上个世纪初，对通过辐射或化学品在DNA内部诱导突变的可能性的发现已经为理解活体内基因功能带来了相当大的希望。自那时起，诱变作用和自然序列变化已经被广泛地用于鉴定新功能、对应于特异功能的基因以及一个特异蛋白质内部的活性位点。实施这个方法的一个关键方面，特别是在点突变的情况下，是对突变检测方法的选择，这些方法被设计为对大段的DNA进行筛选而不减少诊断敏感性或特异性，并且同时能提供有关突变位点的信息。最常用的工具当中有基于不完全配对的DNA的方法，该DNA 能够通过两个DNA分子的变性和复性在试管内产生。使用如沟结合剂等化学品或能够在错配位点上特异地剪切单链DNA的分子在这些异源双链分子中检测到错配。可替代地，单链特异的内切核酸酶已经被用于在错配位点剪切DNA。目前已被描述的绝大多数内切核酸酶属于S1/P1类核酸酶。例如SI、Pl和绿豆核酸酶等核酸酶，属于被命名为“S1/P1族核酸酶”或为“S1 族核酸酶”的同一族，已知能用于在单链区域切开DNA。但是这些核酸酶所具有的酸性pH 最佳值是在4. 0-5. O的范围内。这对于错配检测是不利的，因为低pH值有利于DNA脱嘌呤并且使得DNA双链体不稳定，导致非特异的DNA降解，并且降低检测的敏感性和特异性。几年前，0LEYK0WSKI等人(Nucleic Acids Res，26，4597-4602，1998)从不同的植物提取物中检测到一个错配内切核酸酶的活性，其具有中性的pH最佳值(大约pH 8)并在错配位点的3’端完成一个单链切开。这些作者报道了该错配内切核酸酶的活性与苜蓿芽、 芦笑、疗菜和西红柿的提取物中的甘露糖基糖蛋白(mannosyl glycoproteins)有关。疗菜中的酶，称之为CEL I，是通过连续的硫酸铵沉淀步骤从芹菜茎中提纯，结合到一个刀豆体球蛋白A-琼脂糖柱并且被-d+-甘露糖洗提，结合到一个磷酸纤维素柱并且被线性梯度的KCl洗提，并且用尺寸排阻色谱法分级分离。因此获得的CEL I制品包含几个34-39KDa 的蛋白带。YANG 等人(Biochemistry，39，3533-3541，2000)和 PCT 申请 WO 01/62974 描述了一种改进的CEL I提纯，它是通过在提纯缓冲液中使用α-甲基甘露糖苷来克服CEL I与内源性选择素的聚集反应。这些文件还披露了 CEL I cDNA的克隆。以序列数据为基础，CEL I 被指定为S1/P1族核酸酶的一个亚族,并且鉴定出几个用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 BFNl (GenBank 核苷酸(nucleotide)AY040016)、百日草属植物的 ZENl (GenBank 核苷酸 AB003131)和萱草的DSA6 (GenBank核苷酸AF082031)的基因进行编码的可能的同系物。CEL I内切核酸酶活性已经显示出对于碱基替换的错配以及由于插入/缺失情况引起的错配是高度特异的，并且独立于侧翼序列环境。因此它在包括突变筛选等不同的方法中作为突变检测试剂是很有用的。CEL I错配检测系统是一个简单的测定法，它需要靶序列的聚合酶链反应扩增(PCR扩增)、变性和退火，以允许在野生型和突变体等位基因之间生成异源双链体，酶的错配剪切，以及通过凝胶电泳法的产品分析。因为它在对大段DNA中的错配进行检测时的特异性和敏感性，它比其他流行的错配检测系统有利，比如变性HPLC。通过实施例，0LEYK0WSKI等人和YANG等人(上面引用的出版物)报道将其用于检测人类与家族性乳腺癌有关的基因(BRCA1基因)的序列改变，并且S0KURENK0等人(Nucl. Acids Res.，29，elll，2001)披露了将其用于检测大范围基因组DNA的突变和多态性。CEL I也在TILLING(基因组中祀向诱导的局部损害(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))的高产率筛选中得到使用，其中化学诱变之后对基因点突变进行筛选，或将其用于检测自然群体中的多态现象，也被称作“Ecotilling” ( COMAI等人，Plant Journal, 37，778-786，2004)。它已经被用在植物(COLBERT 等人，Plant Physiology 126,480-484, 2001 ;TILL 等人，Genome Research 13，524-530，2003 ;PERRY 等人，Plant Physiology 131,866-871,2003)和动物中，例如斑马鱼(WIENH0LDS 等人，Genome Res. , 13, 2700-2707, 2003)。PCT申请WO 03/066809提出在相关聚核苷酸之中重新配置序列变化的一种方法中使用CEL I,该方法称作“通过解决错配的基因重排列”("Genetic Reassortment by Mismatch Resolution" (GRAMMR))。但是CEL I的缺点是所具有的剪切效率由一个错配到另一个错配而变化在具有单一核苷酸插入的DNA环的情况下，0LEYK0WSKI等人(Nucleic Acids Res. 1998 0ctl5 ； 26(20) :4597-602)报道了 CEL I底物优选特性为G > A > C > T ;在碱基替换的错配情况下，CEL I底物优选特性为C/C彡C/A C/T彡G/G > A/C A/A T/C > T/G G/T G/A A/G > T/T。它的功效在错配C/A，C/C，C/T，G/G是很明显的。在其他的错配上观察到活性降低，它对于错配T/T几乎无效。当需要在一个DNA库中对某一等位基因进行检测时，这种剪切功效上的变化可能会导致在检测某些突变时的较低正确率。限制CEL I应用的另一个不便之处是可用的提纯法的低产率。OLEYKOffSKI等人从含有大约350克蛋白质的7千克芹菜茎开始获得了 3ml的0. I μ g/ μ I的CEL I ;由YANG等人和PCT WO 01/62974中披露的提纯过程得到5 μ g纯化的CEL I，特异活性为3. IxlO7CEL I单位/毫克蛋白质，从105千克芹菜茎开始。为了获得更大量的CEL I，已经提出它可以通过重组DNA技术来生产。PCT申请 W003/066809提出了一个可能合适的载体和宿主细胞的很大的清单，包括几乎任何已知的原核或真核生物表达系统；但是，这个文件中实际披露的唯一表达系统是基于烟草花叶病毒组的载体。通过在所述载体中将融合到一个编码为6-组氨酸标签的该CEL I的cDNA进行克隆的构造已经被用于感染烟草植物。重组CEL I从被感染植物的细胞内液中回收，在镍-NTA树脂上通过金属亲和层析法提纯。PCT WO 03/066809对于提纯的酶的产率没有叙述。它表明其在GRAMMR反应中的活性与芹菜中提纯的某一个天然酶近似。这个系统的一个不便之处是病毒倾向于重组，部分或全部失去该表达基因。这带来除了完整长度的CEL I之外还会产生截短的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿卜杜勒菲德·本达马内，贝内迪克特·斯图勒保耶斯，卡利内·特里凯斯，米歇尔·卡博什，
申请(专利权)人：法国植物基因组研究计划华莱，法国国家农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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