一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒，缺失E1区和E3区，在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA。构建方法由构建腺病毒骨架载体、构建携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体、构建携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体、构建携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体、包装和扩增以及纯化步骤组成，携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒在制备治疗遗传性疾病药物中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒及其构建方法和应用。
技术介绍
基因组的靶向修饰包括对基因组内源性基因序列的改造或者在基因组的特定位置插入外源性基因片段。这项技术为研究特定基因功能提供了有力工具，此外研究人员可以利用该技术建立特定的动物模型来进行基因功能研究或新药物的研发。传统的基因靶向修饰技术是依赖于自然状态下的同源重组(Homologous recombination, HR),效率非常低，大约为10_6,因而大大限制了该技术的应用。锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技术的出现给基因组靶向修饰带来了希望。ZFN技术是近年来发展起来的一项新的技术，通过人工设计的ZFN在基因组DNA的特定位置切割产生双链断裂(DSB)，继而通过细胞内源性的修复机制对断裂部位的基因进行修饰。同自然状态下的同源重组技术相比较，ZFN技术可以使基因组靶向修饰的效率提高了 IO3 IO5倍。ZFN介导的基因定点修饰已经在多种体外培养的细胞中获得成功，包括人的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)和诱导性多能干细胞(induced pluripotentstem cells, iPS)、植物、果蝇、爪蟾、线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠等的细胞,显示出该技术的广泛适用性，这将有力地推动基因靶向修饰技术的应用研究。由于ZFN介导的基因靶向修饰技术 需要将ZFN表达元件和供体DNA同时导入到细胞中，因此将ZFN表达元件和供体DNA导入靶细胞的效率成为影响ZFN介导的基因靶向修饰的效率的重要因素。在体外实验中通常采用核转染的方法，这种方法转染效率较高，然而该方法只局限于部分细胞，对有些细胞的转染效率仍然是很低的，且该方法无法在体内实验中使用。腺病毒载体由于其诸多特点，如:宿主范围广、病毒滴度高、载体容量大等，成为将ZFN表达元件和供体DNA同时导入到靶细胞中的一种理想的工具。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒的构建方法。本专利技术所要解决的还有一个技术问题在于为携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒提供一种新用途。解决上述技术问题所采用的技术方案是:缺失El和E3区，在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA。本专利技术在缺失的El区插入供体DNA、在缺失的E3区插入锌指核酸酶表达元件，或在缺失的El区插入锌指核酸酶表达元件、在缺失的E3区插入供体DNA。本专利技术的锌指核酸酶表达元件是由真核启动子与其下游的锌指核酸酶基因和转录终止信号组成。本专利技术的真核启动子是Tet-on诱导性启动子,该Tet-on诱导性启动子由以下结构组成-J个重复的四环素反应元件，在该重复序列两端连接有启动子核心元件，包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S_M2转录因子和SV40pA，在右侧tightminiCMV的下游插入一对锌指核酸酶基因，在锌指核酸酶基因的3 ’端连接有转录终止信号；所述的两个锌指核酸酶基因间通过自剪切多肽相连；所说的转录终止信号是SV40pA、TKpA中的一种；miniCMV的序列如下:GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCtight miniCMV 的序列如下:GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。本专利技术的供体DNA是靶向该腺病毒所携带的锌指核酸酶的识别位点，它由上、下游同源臂组成，上、下游同源臂分别是由距离该腺病毒载体携带的锌指核酸酶的识别位点Ibp到5000bp碱基数的DNA序列组成，每条同源臂的长度为50bp到3000bp。本专利技术的供体DNA在上、下游同源臂之间插入了限制性内切酶位点、报告基因表达元件、筛选基因表达元件、功能基因表达元件中的任意一种。 上述携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒的构建方法由以下步骤组成:1、构建腺病毒骨架载体以商业化的pAdEasy-Ι载体为基础进行改造。构建腺病毒E3区穿梭载体，在E3区穿梭载体中插入IacZa筛选基因和Swa I酶切位点，通过同源重组和蓝白斑筛选将Swa I酶切位点引入到腺病毒缺失的E3区，获得可以在缺失的E3区插入外源基因的腺病毒骨架载体。2、构建携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体将真核启动子、锌指核酸酶基因、转录终止信号依次插入到腺病毒E3区穿梭载体中。3、构建携带供体DNA的腺病毒El区穿梭载体将供体DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒El区穿梭载体，在上、下游同源臂之间插入限制性内切酶位点、筛选基因表达元件、功能基因表达元件中的任意一种。4、将携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体与Swa I线性化的腺病毒骨架载体同源重组获得携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体，将携带供体DNA的腺病毒El区穿梭载体与携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体同源重组获得携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体。5、将构建好的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞进行包装、扩增、纯化获得纯化的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒。携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒在制备治疗遗传性疾病药物中的用途。附图说明图1是pAdEasy-Ι载体的结构图。图2是腺病毒E3区穿梭载体pE3 shuttle的结构图。图3是腺病毒骨架载体pAd5 backbone的结构图。图4是锌指核酸酶表达元件Tet on AAVSl ZFN结构图。图5是pEl/AAVSl donor载体的结构图。图6是携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒结构图。图 7 是 Ad5(E3)Tet on AAVSl ZFN/ (El)AAVSl donor 对 U2-0S 细胞中 AAVSl 位点靶向修饰效率检测。图8 是 pEl/AAVSl UP-CMV-eGFP-TKpA-DOWN 载体的结构图。 图9是pE3 shuttle Swa I载体的结构图。图10是小鼠部分活化凝血酶原激酶时间检测结果。具体实施方案下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术不限于这些实施例。实施例1以携带靶向AAVSl的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒为例，该腺病毒的结构如下:该腺病毒载体是5型腺病毒载体，缺失了 El区和E3区。在缺失的E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成-J个重复的四环素反应元件(TRE),在7个重复的TRE两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tig本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒，其特征在于：缺失E1和E3区，在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA。
【技术特征摘要】
2012.11.09 CN 201210447965.61.一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒，其特征在于:缺失El和E3区，在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA。2.根据权利要求1所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒，其特征在于:在缺失的El区插入供体DNA、在缺失的E3区插入锌指核酸酶表达元件，或在缺失的El区插入锌指核酸酶表达元件、在缺失的E3区插入供体DNA。3.根据权利要求1或2所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒，其特征在于:所述的锌指核酸酶表达元件是由真核启动子与其下游的锌指核酸酶基因和转录终止信号组成。4.根据权利要求3所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒，其特征在于:所述的真核启动子是Tet-on诱导性启动子，该Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的四环素反应元件，在该重复序列两端连接有启动子核心元件，包括左侧的miniCMV和右侧的tightminiCMV，在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S_M2转录因子和SV40pA，在右侧tight miniCMV的下游插入一对锌指核酸酶基因，在锌指核酸酶基因的端连接有转录终止信号；所述的两个锌指核酸酶基因间通过自剪切多肽相连；所说的转录终止信号是 SV40pA、TKpA 中的一种； miniCMV的序列如下:GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC tight miniCMV的序列如下:GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC05.根据权利要求1或2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，张伟锋，刘思也，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。