一种重组核酸酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。本发明专利技术的重组核酸酶，由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。本发明专利技术还提供了制备重组核酸酶的方法，包括基因序列的优化、融合标签肽段的编码序列与核酸酶基因相连接、克隆、转化和筛选高表达菌株、培养并进行分离纯化得到高纯度重组核酸酶。本发明专利技术的重组核酸酶及其制备方法，表达方案简单，表达量高，达到30％，纯化工艺特异性强，收率高。本发明专利技术的重组核酸酶应用于医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中很容易利用亲和层析技术从产品中去除，有助于提高产品质量。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。本专利技术的重组核酸酶，由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。本专利技术还提供了制备重组核酸酶的方法，包括基因序列的优化、融合标签肽段的编码序列与核酸酶基因相连接、克隆、转化和筛选高表达菌株、培养并进行分离纯化得到高纯度重组核酸酶。本专利技术的重组核酸酶及其制备方法，表达方案简单，表达量高，达到30％，纯化工艺特异性强，收率高。本专利技术的重组核酸酶应用于医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中很容易利用亲和层析技术从产品中去除，有助于提高产品质量。【专利说明】-种重组核酸酶及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。
技术介绍
生物技术产品在高效表达时宿主细胞或菌体也大量增殖，这一过程中往往伴随着 大量的宿主或菌体核酸的扩增，在后续的分离过程中大量的核酸释放会给目标产品的分离 纯化增加难度，同时部分残留宿主DNA与产品结合也很难去除。宿主细胞的DNA同药物一 起进入人体会产生不可预料的副作用，残留DNA可能造成机体DNA的插入突变，导致抑癌基 因失活、癌基因被激活等，有可能造成药物使用者致癌，因此宿主细胞DNA残留量是产品质 量控制的重要指标之一。 许多机构都对重组蛋白类药物的DNA残留制定了严格的标准，1984年的国际会议 上采纳了残余DNA的临时限度标准，即来自连续传代细胞系的生物制品每人份剂量DNA残 留不能超过l〇pg。1986年WHO会议一致认为不高于100pg/剂量的细胞DNA对于非口服途 径的产品，其危险性是可以忽略不计的。1987年，美国FDA建议每人份剂量残余细胞DNA的 可接受限度为l〇pg。1997年，美国FDA将生物制品可以允许的残余DNA限度修改为不超过 100pg。欧洲药典通则中对于残余DNA的限度规定为不超过10ng/剂量，但针对个别疫苗 (如甲型肝炎灭活疫苗残余DNA应不超过100pg/剂量；乙型肝炎疫苗DNA残留量应不超过 l〇pg/剂量）会有所不同。 1990年2月，卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》3. 3. 1. 6条款规定， 必须用敏感的方法测定来源于宿主细胞的残余DNA含量，这对于用哺乳动物传代细胞（转 化的细胞系）生产的制品尤为重要。一般认为残余DNA含量小于100pg/剂量是安全的。 《中国药典》三部（2005年版）对CH0细胞表达的重组乙型肝炎疫苗提出CH0细胞残余DNA 含量不高于l〇pg/剂量。近几年，我国采用Vero细胞生产灭活疫苗逐渐增多，疫苗的种类 包括人用狂犬病纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、乙型脑炎纯化疫 苗。《中国药典》（2005年版三部）及（2010年版三部）对于V ero细胞培养疫苗一般要求 残余外源DNA不超过100pg/剂量。 生物组织及菌体裂解后大量的核酸释放使样品的黏度很高，不利于分析及从中分 离目标产品。使用核酸酶降解DNA是除去宿主细胞DNA残留的常用方法。核酸酶通过降低 生物制品，尤其是病毒类产品外源性核酸的含量，减少过敏反应，提高制品安全性。工程细 胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，缩短处理时间，提高蛋白产量，离心时有利于沉淀 和上清液的分离，超滤时有利于各成分的分离，提高柱层析纯化时的有效性。颗粒（病毒、 包涵体等）用核酸酶预处理有助于颗粒的纯化。在ELISA、柱层析、二维电泳和免疫印迹等 生物样品分析中，通过核酸酶的作用可提高分辨率和回收率。 非特异性核酸内切酶是一类高活性的水解酶，其最大特点是能非特异性地降解 几乎所有形式的核酸。来自粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶（Serratia marcescens non-specific endonuclease，SMNE，E. C. 3· 1· 30. 2)是其中的典型代表，该酶能降解各种形 式核酸的核酸内切酶，包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA以及基因组DNA，对核酸的序 列没有严格要求，并且没有蛋白酶活性。该酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能 将核酸完全消化成杂交限度以下的2-5个碱基长度的5' -单磷酸寡核苷酸。 该酶由分子量为30kDa的两个亚基组成，作用的pH范围为6?10,温度0?42°C， 酶发挥活性需要1?2mM Mg2+。在离子型及非离子型表面活性剂和lmm〇l/L PMSF，lmmol/ LEDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mmol/L的单价阳离子，大于100mmol/L的 磷酸根，大于100mm〇l/L硫酸铵和大于100mmol/L盐酸胍抑制酶的活性。 核酸酶具有广阔的应用前景，目前市场上销售的核酸酶产品主要是德国Merck公 司的Benzonase? endonuclease。该产品是将Serratia marcescens核酸酶基因克隆到 pNUCl质粒载体，转化大肠杆菌W3310实现核酸酶基因的分泌表达，生产工艺保证了产品的 纯度和活性，使该产品同自然提取酶相比，最大限度地降低了蛋白酶活性和病毒污染。 美国Acambis公司的ChimeriVax? Platform疫苗研究平台系统，米用黄热病毒载 体研究生产登革热、WN和JE脑炎疫苗。这些重组疫苗的研发始于1997?1999年，在2000? 2003年获得IND批准。在质量控制方面包括：（1)种子系统（外源因子检测，逆转录病毒检 测，效力，基因序列鉴别和免疫染色鉴别，小鼠和猴体神经毒力的安全性，无菌性等）；（2) 疫苗收获液检定（无菌性，效力，外源因子检测，逆转录病毒检测，基因序列鉴别等）；（3)纯 化的疫苗原液（无菌性，效力，基因序列鉴别，HAS，残余DNA检测，内毒素等）；(4)半成品 (无菌性，效力，基因序列鉴别和免疫染色鉴别小鼠神经毒力安全性，残余Benzonase检测， 残余DNA检测，赋形剂，渗透压等）；（5)成品（无菌性，内毒素，免疫染色鉴别，一般安全性、 外观、pH、渗透压、赋形剂等）。这表明Benzonase核酸酶已经用于疫苗的开发和生产。 2007年，薛惠斌在腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制及其大规模扩增-纯 化的初步研究中应用Benzonase提高重组腺病毒的质量，工艺条件：最佳的作用浓度在 100?200u/ml，置于37°C水浴，60分钟。重组复制型溶瘤腺病毒p53产品工艺中也使用了 benzonase酶，质量标准制定了相应的残留量检测项目。《Vaccine》杂志2007年发表了关于 人用罗斯河病毒感染（Ross River virus)疫苗的临床前试验文章，其中疫苗制备工艺首先 是40升反应器中病毒的微载体培养，然后收获培养上清进行过滤，滤液中加入Benzonase 核酸酶处理，浓度2000U/L，37°C，1小时以消化残留的Vero细胞DNA。后续病毒经甲醛灭活 24小时后再加入Benzonase核酸酶1000U/L以进一步处理残留的核酸。 2009年发表于《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》的一项关于腺病毒载体纯 化的石开究（Purification of adenoviral 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸酶，其特征在于：由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国安，徐辉，方芳，
申请(专利权)人：杭州俊丰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33