dsRNA内切核糖核酸酶制造技术

本发明专利技术涉及一种新的双链RNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，所述酶含有位于双链RNA大沟内并与其相互作用的环，在双链RNA切割中呈现序列特异性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及一种新的双链RNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，所述酶含有位于双链RNA大沟内并与其相互作用的环，在双链RNA切割中呈现序列特异性。【专利说明】dsRNA内切核糖核酸酶专利
本专利技术主题为显示双链RNA (dsRNA)序列特异性切割活性的dsRNA内切核糖核酸酶、获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法、获得具有在dsRNA切割中序列选择性改变的dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体的方法、基因构建体、宿主细胞、编码dsRNA内切核糖核酸酶的基因在生产dsRNA内切核糖核酸酶中的用途、试剂盒和显示dsRNA内切核糖核酸水解活性的酶。
技术介绍
分子生物学的基本工具之一为具有明确定义活性的蛋白，其用于例如基因工程、诊断学、医学和多种产品的生产和加工工业。 DNA限制性内切核酸酶为序列依赖性酶，其识别和切割双链DNA的特定序列。还已经知道在给定序列切割RNA的酶，然而，这样的酶作用于RNA的单链位点。这些酶的实例包括噬菌体蛋白RegB (在序列GGAG的中间切割单链RNA)和核糖核酸酶Y (在富含A或AU的序列中切割单链RNA)。这些酶需要额外的决定因素以便有效切割，例如RNA 二级结构和在RegB的情况下与核糖体蛋白SI的相互作用(Lebars, 1.，等，J Biol Chem (2001) 276，13264-13272 ；Saida, F.等，(2003) Nucleic Acids Res, 31，2751-2758和Shahbabian,K.等，The EMBO Journal (2009) 28，3523 - 3533)。还尝试了改变核糖核酸酶 Tl 和核糖核酸酶MCl 的特异性(Hoschler, K.等 J Mol Biol, (1999) 294，1231-1238 ；Numata,T.等，Biochemistry, (2003) 42，5270 - 5278)。在这两种情况下，产生了特异性增强(从一个核苷酸到两个核苷酸)的酶变体(Numata, T.等，Biochemistry, (2003) 42，5270-5278 ；Czaja, R.等，Biochemistry, (2004) 43，2854-2862 ；Struhalla, Μ.等Chembiochem, (2004) 5，200-205)。然而，所有这些核糖核酸酶的序列特异性仍非常有限，这使得它们不适合在与DNA限制酶的应用相似的应用中作为分子生物学工具。核糖核酸酶III为切割双链RNA (dsRNA)的核酸酶的原型，并且为核糖核酸酶III超家族蛋白的创始成员，该家族蛋白共有一个进化上保守的催化结构域。基于存在的额外的结构域，它们被分为四类。第I类，即传统的核糖核酸酶III酶，具有一个双链RNA结合结构域(dsRBD)和单一的核糖核酸酶III结构域。第2类和第3类酶分别以Drosha和Dicer为代表，二者均包含两个核糖核酸酶III结构域以及单一的dsRBD。此外，属于第2类的酶具有额外的结构域，例如聚脯氨酸结构域，并且属于第3类的DExD解旋酶具有DUF283和PAZ结构域。第4类，被称为Mini III，包括由核糖核酸酶III结构域单独组成的酶。枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5.Mini III蛋白的天然底物为23S前-rRNA,其中该分子的3'和5'末端被除去产生成熟的23S rRNA。该酶的切割位点是已知的，然而在双链前-rRNA的切割位点附近，23S前-rRNA的一个片段形成不规则螺旋，推测其为底物识别所必需的(Redko, Y.等，Molecular Microbiology, (2008) 68 (5)，1096-1106)。此外，Mini III的体外内切核糖核酸水解活性被证明受与23S rRNA 3'末端结合的核糖体蛋白L3刺激。存在蛋白L3通过改变RNA的构象促进底物切割的间接证据(Redko，Y.等，Molecular Microbiology, (2009) 71 (5)， 1145-1154)。对于特异的和确定的dsRNA断裂，尚无与DNA限制性内切核酸酶或DNA切口酶相似性质的酶(JP 54059392 - A, 12.05.1979)。dsRNA可被来自核糖核酸酶III家族的内切核糖核酸酶切割，但核糖核酸酶ΠΙ-dsRNA相互作用的细节未知(Herskovitz，Μ.Α.等，Molecular Microbiology, (2000) 38 (5)，1027-1033)。位点特异性结合和选择性加工的标准仍不清楚(Dasgupta S.等，Molecular Microbiology, (1998) 28 (3)，629-640)。然而，非特异性dsRNA内切核酸酶已用于产生短的双链RNA片段(US 2006057590 - Al,16.03.2006, NOVARTIS)。获得在dsRNA切割中显示序列特异性的酶将允许发展RNA操作技术的所有领域，并且还允许开发新研究方法、所述酶的新应用以及由其衍生的新技术。公开内容 依照所描述的技术发展水平，本专利技术目的为克服指出的缺点并提供具有高度序列特异性识别和切割的dsRNA内切核糖核酸酶。本专利技术目标还为提供检测、分离、选择、获得和制备这样的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶及其改良变体的方法。 本专利技术人意外地发现来自核糖核酸酶III超家族的一种酶可具有切开特定dsRNA核苷酸序列的偏好，根据计算机模拟该酶包含一个位于dsRNA螺旋的大沟内并与其相互作用的环。本专利技术人发现这样的偏好只取决于dsRNA序列，并且不依赖存在无规则dsRNA螺旋结构和/或与其它蛋白的相互作用。本专利技术人发现该酶属于核糖核酸酶III超家族，其包含在计算机模拟中形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的多肽链片段，能够进行与DNA限制性内切核酸酶相似性质的特异的和确定的dsRNA断裂。本专利技术的一个方面提供在dsRNA切割中显示序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶和/或其在dsRNA切割中显示序列特异性的衍生物和/或变体，所述酶含有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环。在优选的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体中，位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环含有这样的dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列:其与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶Mini III的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应。在优选的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体中，位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环与由以下片段形成的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应:来自具核梭杆菌(Fusobacterium nuclea turn)的内切核糖核酸酶FNU片段(如SEQ ID N03中所示)和/或来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSU片段(如SEQ ID N04所示)和/或来自蜡样芽孢杆菌^Bacillus cereus)的内切核糖核酸酶BCE片段(如SEQ ID N05所示)OdsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体优选包含来自SEQ ID NOl的枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU的氨基酸序列的序列或片段，所述序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM布尼基，KJ斯科罗内克，D皮安卡，AA苏勒，
申请(专利权)人：国际生物分子和细胞研究所，
类型：
国别省市：