一种重组耐热的β-1,4内切纤维素酶的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种重组耐热的β-1，4内切纤维素酶的纯化方法，主要步骤为破菌、热处理、离心、金属螯合亲和层析、盐析。本发明专利技术具有纯度高、比活高、收率高、生产成本低、有利于工业化生产的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物酶的纯化方法，特别涉及一种重组耐热纤维素酶的纯化方法。
技术介绍
纤维素是地球上含量最丰富的多糖，也是最丰富的有机可再生资源。纤维素酶是分解纤维素的一类酶，根据功能的不同，分为外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶，它能将纤维素分解成为葡萄糖，一种机理是:内切葡聚糖酶首先将纤维素的非结晶区切开，产生大量的非还原端，作为纤维二糖水解酶底物，依次从非还原端切下纤维二糖，被葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。目前工业上使用的纤维素酶大多来源于真菌发酵产物，只能在中温条件下发挥作用，限制了酶的应用，而耐热纤维素酶因具有极好的高温反应活性和稳定性，在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。来源于Euryarchaeota门热球菌目的热球菌高度嗜热，产生的耐热纤维素酶，由于具有较高的酶活力和热稳定性，日益被人们所关注，成为纤维素酶基础研究和开发新型纤维素酶制剂的热点。许多研究者构建表达了来自热球菌的耐热纤维素酶，例如国际专利PCT/DK98/00039,论文Kengen 1993和Bauer 1999，表达的耐热纤维酶的反应最适温度都在90°C以上，但是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组耐热的β?1，4内切纤维素酶的纯化方法，其特征在于：由以下步骤组成：1)破菌发酵获得表达重组耐热β?1，4内切纤维素酶的菌体，离心后向菌体沉淀加入破菌缓冲液，使菌体和破菌缓冲液的比例为1∶5～20，搅拌10～20分钟使之混合均匀，通过超声或高压均质的方法裂解菌体，使之破碎；2)热处理将破菌处理后的溶液放入水浴中保温搅拌，温度为70～85℃，搅拌速度控制在100～200rpm，处理时间为15～40分钟；3)离心将热处理后的溶液放入离心机中离心，离心力10000～20000×g，时间10～20分钟，取上清液，加入1～2M?MgCl2至终浓度为10mM～20mM，经0.45μm的滤膜过滤；4...

【技术特征摘要】
1.一种重组耐热的β-1，4内切纤维素酶的纯化方法，其特征在于:由以下步骤组成: 1)破菌 发酵获得表达重组耐热β-1，4内切纤维素酶的菌体，离心后向菌体沉淀加入破菌缓冲液，使菌体和破菌缓冲液的比例为1: 5 20，搅拌10 20分钟使之混合均匀，通过超声或高压均质的方法裂解菌体，使之破碎； 2)热处理 将破菌处理后的溶液放入水浴中保温搅拌，温度为70 85°C，搅拌速度控制在100 200rpm，处理时间为15 40分钟； 3)离心 将热处理后的溶液放入离心机中离心，离心力10000 20000 X g，时间10 20分钟，取上清液，加入I 2M MgCl2至终浓度为IOmM 20mM，经0.45 μ m的滤膜过滤； 4)金属螯合亲和层析 金属螯合层析首先用缓冲液I平衡色谱柱，用量为3 5CV，上样后冲洗，用量为5 10CV，使UV280吸收降至基线，然后用缓冲液II洗脱杂蛋白，用量为5 10CV，使UV280吸收降至基线，最后用缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu组分，加入固体硫酸铵至饱和浓度60 70%进行沉淀，得到呈混悬状态的蛋白产品置于4°C长期保存； 其中破菌缓冲液为 20 50mM Tris-HCl，pH7.5 8.5、0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、溶菌酶0.5 2mg/ml、5 IOmM咪唑、0.02 ImM PMSF ;缓冲液I为20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑春阳，聂立影，原素英，王燕，徐彬，
申请(专利权)人：天津强微特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：