一种耐热的内切-β-1,4-葡聚糖酶制造技术

在至少９０℃的温度下具有内切－β－１，４－葡聚糖酶最佳酶活性的一种酶制剂可得自属于古生物的一个菌株，或者是其内源物，如克隆自激烈热球菌ＤＳＭ３６３８、并且可由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１　ＤＮＡ序列编码的一种内切－β－１，４－葡聚糖酶。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,4－葡聚糖酶的制作方法
本专利技术涉及一种在高温时有纤维素分解活性的酶，特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶；编码该有纤维素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供编码这种酶的基因的方法；生产这种酶的方法；一种含有所述具纤维素分解活性的酶的酶组合物；以及该酶和酶组合物的多种工业应用。
技术介绍
纤维素酶或纤维素分解酶是参与纤维素水解过程的酶。天然纤维素的水解中，众所周知有三类主要的纤维素酶参与这一过程，即纤维素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)构成一组可用于上述工业用途的引人注意的水解酶。内切-β-1，4-葡聚糖酶催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中1，4-β-D-糖苷键的内切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纤维素部分的其他植物材料中的β-1，4键的内切水解。其权威命名是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本说明书使用简称内切-β-1，4-葡聚糖酶。可以参考T.M.Enveri，“微生物纤维素酶”，W.M.Fogarty，微生物酶类与生物技术，应用科学出版社，183-224页(1983)；酶学方法(1988)160卷，200-391页(Wood，W.A和Kellogg，S.T.编)；Beguin，P.“纤维素降解的分子生物学”，微生物学年度综述(1990)，44卷，219-248页；Beguin，P.和Aubert，J-P.“纤维素的生物降解”，FEMS微生物学综述13(1994)25-58页；Henrissat，B.“纤维素酶及它们与纤维素的相互作用”，纤维素(1994)，1卷，169-196页。纤维素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌，也能由植物合成。特别是已鉴定到具有各种特异性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。已描述过许多细菌内切-β-1，4-葡聚糖酶(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化学杂志293781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志139187-194)。比较上位的分类组古生物(Archaea)分成两个门Euryarchaeota和Crenarchaeota。古生物中Euryarchaeota门内的热球菌目包含热球菌属(Pyrococcus)和热球菌属(Thermococcus)(Maidak等，1996)。这些生物体分离自海洋或陆地硫酸盐环境中，它们是厌氧性生物，高度嗜热。激烈热球菌在100℃时生长情况最好，并且最高生长温度是103℃。在15-35g/l NaCl存在时可达到最佳生长状况。已有记载表明激烈热球菌利用肽、蛋白质、淀粉以及麦芽糖作为碳源(Zilling，1992)。来自多种古生物的各种细胞外酶已有记载。例如，已在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆和表达了来自激烈热球菌DSM 3638、最适温度约为100℃的一种淀粉酶(国际专利申请PCT/DK/90/00074)。来自各种古生物的其它水解酶(如细胞外木聚糖酶、β-甘露糖苷酶和β-半乳糖苷酶)以及胞内蛋白酶都有记载(Halio等，1996)。已记载、鉴定和克隆了一种来自激烈热球菌DSM 3638的β-葡糖苷酶(Kengen，1993)。对该激烈热球菌β-葡糖苷酶的鉴定工作揭示出，该酶对纤维素或其它β-连接的葡萄糖聚合物没有活性(Bauer等，1996)。WO 97/44361(第115-117页)中公开了一种多核苷酸序列，该序列编码来自激烈热球菌、具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的一种多肽。Thermophilum pendens是与古生物Crenarchaeota门热棒菌属有关的一种生物，已证实它能产生少量在88℃对羧甲基纤维素有活性的葡聚糖酶。然而，无论是酶还是分离物，都未见有进一步鉴定的记载(Bragger等，1989)。木糖葡聚糖酶活性不包括在酶命名法(1992)提供的酶分类中。迄今为止，这一酶促活性仅仅被归类为葡聚糖酶活性，并常常被视为与纤维素分解活性(EC3.2.1.4)，即对纤维素或纤维素衍生底物中β-1，4-糖苷键作用的活性相同，或者至少是具有纤维素分解活性的酶的一种次要活性。然而，一种真正的木糖葡聚糖酶是一种真正的木糖葡聚糖特异性酶，能够催化木糖葡聚糖溶解形成木糖葡聚糖寡糖，但不具有明显的纤维素分解活性，如对常规所用纤维素样底物CMC(羧甲基纤维素)、HE纤维素和Avicel(微晶纤维素)作用的活性。木糖葡聚糖酶切割木糖葡聚糖骨架内的β-1，4-糖苷键。木糖葡聚糖酶活性由Vincken等人(1997)进行了描述，他们从绿色木霉(类似于T.reesi)中鉴定出了三种不同内切-β-1，4-葡聚糖酶，它们对纤维素或CMC都有很高活性，并且，EndoI对木糖葡聚糖基本上没有(即非常少)活性，EndoV(属于糖基水解酶的第7家族)和EndoIV(属于糖基水解酶的第12家族)二者对木糖葡聚糖和CMC都分别有相同数量级的活性。因此，人们估计，第12家族的内切-β-1，4-葡聚糖酶也可能具有木糖葡聚糖酶活性。纤维素分解酶一种非常重要的工业用途是用来处理纤维素纤维、纺织品或织物，例如作为洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物的成分，用于纺织工业中纤维素材料的酶促精练，机织织物的脱浆，新织物的生物抛光(衣物整理)，及获得含纤维素织物(特别是粗斜纹布)的“石洗”外观，这些处理过程的一些方法例如在GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876，WO 91/17243，WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中已被提及。纤维素分解酶另一个重要的工业用途是用于处理纸浆，如用于改善排水或回收纸张的除墨。人们还知道，纤维素酶可以含有或不含有纤维素结合结构域(CBD)。CBD能够增强酶与含纤维素之纤维的结合，并提高该酶催化活性部位的功效。仍然需要提供新型纤维素酶制剂，可以用在那些希望有纤维素酶(优选是内切-β-1，4-葡聚糖酶)活性的应用中。本专利技术的目的是提供新型酶组合物，所述酶组合物在高温条件下具有显著的纤维素分解活性，并且在纸浆加工、纺织品处理、洗衣过程、提取过程或动物饲养中的性能有所改进；优选新型纤维素酶，更优选性能很好的内切-β-1，4-葡聚糖酶，预计这些酶可通过重组技术产生或是通过重组技术产生的。专利技术概述本专利技术人已经成功克隆和鉴定了一种来自古生物激烈热球菌的DNA序列，它编码一种在极高温度下、很宽的pH范围内具有纤维素分解活性的酶，从而有可能用它来制备具有所期望特性的单组分纤维素分解酶组合物。因此，本专利技术第一方面涉及具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶制剂，它在至少90℃、优选至少95℃、更优选至少100℃的温度下具有最佳活性。该制剂可得自属于古生物、优选属于Euryarchaeota门、更优选属于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有内切－β－１，４－葡聚糖酶活性的酶制剂，它在高于９０℃的温度下有最佳活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LN安德森，ME布约恩瓦德，M舒莱恩，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]