本发明专利技术是用于表达、传递及纯化目标多肽的重组载体分子。提供具有来自热稳定酶的氨基酸序列的重组载体分子和用于表达、回收和传递在活体外或活体内不同体系(细菌、酵母、DNA、细胞培养物，诸如哺乳动物、植物、昆虫细胞培养物、原生质体和全植株)中产生的外源序列(肽和多肽)的方法。还使用来自地衣多糖酶B(Lic?B)的序列制备了重组载体分子且将其用作载体蛋白的一部分来表达、回收和传递所讨论的各种目标多肽。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是针对蛋白质表达、纯化及分子生物学领域。特定而言，本专利技术是针对载体蛋白表达，其中使用热稳定酶的成 熟多肽作为载体分子以供产生、回收及传递目标多肽。载体分子可用于在包括植物及哺乳动物细胞培养物的不同表达体系及宿主中产生外源序列。
技术介绍
疫苗是防止并甚至消除传染性疾病最有效的方法。尽管有大量基于全病原体的有效疫苗，但是研制基于部分病原体(亚单位疫苗)的更安全有效而且更经济的疫苗是很重要的。过去二十年中已经研究出若干疫苗抗原表达(细菌、酵母、哺乳动物细胞培养物及植物)及传递(DNA、活病毒载体、纯化蛋白、植物病毒粒子)的方法。所有这些方法对研发和检验新近研制出的候选疫苗具有显著影响。然而，需要改进表达和传递体系以产生更有效而更安全并具有更小副作用的疫苗。未来疫苗所希望的某些特点为:(a)高效(刺激免疫体系的两个臂)，(b)具有已知和受控基因组成，(C)具有体系时效性，(d)适于表达小型肽及大型多肽两者，(e)适于在不同体系(细菌、酵母、哺乳动物细胞培养物、活病毒载体、DNA载体、转基因植物和瞬时表达载体)中表达，及(f)能够形成诸如凝聚体(aggregate)或类病毒粒子(virus like particle)之易于回收且具有免疫原性的结构。因此，需要用于以工程学改变、研制和传递有效亚单位疫苗的新颖载体分子。此等载体分子应提供以下优点和灵活性:在不同体系中表达商业上充足量的目标多肽，从源材料中经济地回收目标多肽，容纳不同尺寸(4个氨基酸及更多)的多肽，容纳串连重复的目标多肽，提供增强的免疫功能，用作高通量筛选工具，及用作疫苗免疫原和疾病标记物的传递工具。
技术实现思路
在本专利技术中发现了一种新颖重组蛋白。其将作为一种用于表达和回收有用目标多肽的载体分子，这些目标多肽是用作对抗传染性疾病或甚至癌症的治疗性或预防性药剂。本文发现的载体分子可容纳不同大小(4个氨基酸至IOOkD的蛋白或更大)的多肽(目标多肽)而且可表达于不同体系中。目标多肽可为疫苗抗原。在一般性方面，本专利技术提供一种重组载体分子，所述重组载体分子具有缺少一个或一个以上氨基酸节段的热稳定酶的被修饰成熟多肽，或热稳定酶的实质上完整的成熟多肽，其适于在该成熟多肽的每个N端和C端以及视情况在环区(loop region)中与异源多肽融合。被修饰成熟多肽和实质上完整的成熟多肽保留了它们的热稳定性及/或酶活性。修饰成熟多肽是因为它缺少环区或具有被中断的环区，或在环区中具有至少一个并非自然存在于野生型热稳定酶中的限制位点(restriction site)。在一个优选实施例中，本文发现的载体分子是基于来自热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)的地衣多糖酶(Iichinase B) (IicB)基因(登记号:X63355, [g1:40697])。本专利技术者发现此热稳定细菌酶可用作产生目标多肽用载体分子。其具有暴露于远离活性域的表面上的环状结构。本专利技术者已经发现此环状结构可用于插入目标多肽。所述目标多肽可表达为N端或C端融合或内部融合及/或表达为环状结构插入物。表达被修饰的蛋白质并且表征其任何参数，例如热稳定性、最佳活性的PH与温度条件。工程蛋白(engineeredprotein)保持了其最佳活性的pH与温度条件。工程蛋白也没有改变其在65°C下的热稳定性。因此，本专利技术揭示源自热稳定酶的重组分子，其用作各种异源目标多肽(例如疫苗、激素、抗凝剂(anticoaulant)、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素(interleukin)、造血生长因子等)的载体。在特定实施例中揭示Rec LicB和LicKM。载体蛋白(即连接一个或一个以上异源目标多肽的被修饰或工程学改变的rec LicB或LicKM)为融合蛋白且其可表达于原核或真核体系中。特别是已经发现这些载体分子可容纳小型多肽到高达IOOkD或更多的大型多肽，可容纳相同多肽的串连重复；可表达于不同体系中，包括细菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞培养物、植物、DNA及病毒载体；由于其热稳定性或形成凝聚体的能力可提供回收目标产物的经济优点；可用作筛选目标多肽的高通量体系；抗原、疾病标记物或其它治疗性多肽。本专利技术也揭示一种以融合蛋白形式表达肽的方法，所述方法是通过将热稳定酶的重组成熟多肽用作异源多肽的载体并使用本专利技术所描述的肽表达方法。附图说明图LA:以工程学改变重组LicKM载体分子的图示。I为环状结构。A表示环状结构的上游区域。C表示环状结构的下游区域。为生成LicKM，在环区分裂且如图所示组装编码Lic B的基因。以工程学改变过程中产生单一克隆位点。该图B部分展示工程分子LicKM的核酸序列(SEQ ID NO:1)。使用特异性引物由PCR进行分裂。PCR产生2个亚克隆(图1A)，命名为A (159个核苷酸，364至522)和C (486个核苷酸，523至1009)。在最后的克隆中，沿片段C的下游克隆片段A，保留原始氨基酸组成。图1C展示来自野生型LicB的Rec LicB结构。Rec LicB由不含纤维素分解剂(cel Iulosome)结合域的成熟蛋白组成。目标序列可与N端和C端融合,也可使用BamHI和BglII限制位点融合至环状结构中。图1D展示工程分子Rec LicB的核酸序列(SEQ ID NO:2) 图1E展示由LicKM核酸(SEQ ID NO:1)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。图1F 展示由 Rec LicB (SEQ ID NO:2)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:4) 图1G展示LicKM载体分子变异体的核酸序列(SEQ ID N0:5)。它同样具有在5’端产生的KpnI限制位点和在3’端产生的XhoI限制位点以及在环区的BamHI/Bgl位点。图1H展示由LicKM载体分子变异体(SEQ ID NO:5)编码的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。图2.将GFP克隆至rec Lic B的环状结构中以获得重组Lie B-GFP的图示。GFP的编码区域经PCR扩增并克隆至LicB的开放阅读框(open reading frame)中。用2个步骤由PCR完成克隆。使用图1的图例中所示引物产生2个亚克隆A和C。接着PCR扩增该等编码GFP的序列(在PCR过程中在5’端和3’端分别结合BamHI和BglII限制位点)。接着，使用引入的BamHI和BglII位点将3个片段连接成A-GFP-C以得到LicB-GFP。GFP的引物为:正链:5，gcaggga tcc atg gtg age aag ggc gag3，(SEQ ID NO:7)反链:5，gcagaga tct ctt gta cag ctc gtc cat3，(SEQ ID NO:8) 图3.在0.1%地衣多糖(Iichenan)作为基质存在下检测细菌和酵母提取物中地衣多糖酶(Iichenase)活性的酶谱。在12%PAGE中分离蛋白。向凝胶中载入由E.coli菌株XL-1blue [C对照，LicB (野生型)，LicKM (工程载体分子)和重组LicB-GFP (E)]和酿酒酵母(Saccharromyces cerevisiae)菌株 YPH 857 (LicB-GFP (Y)中提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组多肽，其包含经修饰的地衣多糖酶B(lichenase?B)多肽，所述地衣多糖酶B多肽包含与SEQ?ID?NO：3的氨基酸14?231位或SEQ?ID?NO：6的氨基酸8?226位具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
2003.05.22 US 60/472,4951.一种重组多肽,其包含经修饰的地衣多糖酶B(lichenase B)多肽，所述地衣多糖酶B多肽包含与SEQ ID NO:3的氨基酸14-231位或SEQ ID NO:6的氨基酸8-226位具有至少90%序列相似性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的重组多肽，其中所述经修饰的地衣多糖酶B多肽由SEQID NO:1或5编码。3.如权利要求1所述的重组多肽，其中所述经修饰的地衣多糖酶B多肽包含与SEQIDNO:3的氨基酸14-231位或SEQ ID NO:6的氨基酸8-226位具有至少95%序列相似性的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的重组多肽,其中所述经修饰的地衣多糖酶B多肽包含由SEQIDNO:3或SEQ ID NO:6所示的序列。5.如权利要求1所述的重组多肽，其中所述经修饰的地衣多糖酶B多肽具有SEQIDNO:3的氨基酸14-231位氨基酸序列或SEQ ID NO:6的氨基酸8-226位氨基酸序列。6.如权利要求1所述的重组多肽，其还包含一个与所述经修饰的地衣多糖酶B多肽融合的异源多肽序列以生成融合蛋白。7.如权利要求6所述的重组多肽，其中所述经修饰的地衣多糖酶B多肽与两个或更多个含抗原决定部位的异源多肽片段融合。8.如权利要求6所述的重组多肽，其中所述异源多肽序列包含来自于生长因子、细胞分裂素、配体、受体、抑止子、抗原、抗原决定部位、T细胞抗原决定部位、B细胞抗原决定部位、抗体、水解酶、绿色荧光蛋白、干扰素、白细胞介素、病原体相关蛋白或毒素的一个序列。9.如权利要求6所述的重组多肽，其中所述异源多肽序列包含一个疫苗抗原。10.如权利要求1所述的重组多肽，其还包含一用于分离或纯化或其两者的标签。11.如权利要求10所述的重组多肽，其中所述标签是His6。12.如权利要求6所述的重组多肽，其还包含一酶切割位点。13.如权利要求12所述的重组多肽，其中所述切割位点是位于所述异源多肽和所述经修饰的地衣多糖酶B多肽之间。14.如权利要求1所述的重组多肽，其还包含一个标签和一个切割位点，其中所述切割位点位置与所述标签相邻。15.如权利要求1所述的重组多肽，其还包含一联结子。16.—种编码如权利要求1-15中任一权利要求所述的重组多肽的核酸。17.—种包含如权利要求16所述的核酸的表达载体。18.如权利要求17所述的表达载体，其中所述载体是植物病毒载体。19.一种包含如权利要求17所述的表达载体的宿主细胞。20....
【专利技术属性】
技术研发人员：维达季·尤西波夫，瓦季姆·梅特，康斯坦丁·穆西丘克，
申请(专利权)人：美国弗劳恩霍夫股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。