本发明专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。相关领域描述纤维素是单糖葡萄糖通过P -1, 4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解P -连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和3 -葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合 物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶顺序地从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的￠-1, 4-连接的葡萄糖二聚体。￠-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。在本领域中，改善酶法降解木素纤维素原料的能力会是有利的。本专利技术提供了具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。专利技术概述本专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其选自下组(a)多肽，其与SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii) SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，它由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列具有至少65%序列同一性；(d)SEQ ID NO: 2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；(e) (a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，其具有纤维二糖水解酶活性。本专利技术还涉及编码本专利技术多肽的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞；和产生所述多肽的方法。本专利技术还涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括在本专利技术的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。本专利技术还涉及产生发酵产物的方法，包括(a)在本专利技术的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(C)从发酵回收所述发酵产物。本专利技术还涉及发酵纤维素材料的方法，包括用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中将所述纤维素材料是在本专利技术的具有纤维二糖水解酶的多肽的存在下用酶组合物糖化的。在一个优选的方面，所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。在一个方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。本专利技术还涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸I至16，或由SEQ ID NO:2的氨基酸I至16组成，所述信号肽可操作地连接于编码蛋白的基因；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生蛋白的方法。附图简述附图说明图1显示含或不含褐孢长毛盘菌(Trichohaea saccata)家族GH6多肽的高温酶组合物在50-65°C对经磨制、未洗涤的PCS的水解的作用。定义纤维二糖水解酶术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-^-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(I, 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (E. C. No. 3. 2.1. 91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含￠-1, 4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-P-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri, 1997，Crystalline cellulose degradation:Newinsight into the fun ction of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology15:160-167;Teeri 等，1998，Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why soefficient on crystalline cellulose ，Biochem. Soc. Trans. 26:173-178)。就本专利技术而言，根据 Lever 等，1972，Anal. Biochem. 47:273-279; van Tilbeurgh 等，1982，FEBSLetters,149:152-156;van Tilbeurgh 和 Claeyssens，1985，FEBS Letters, 187:283-288;以及Tomme等，1988，Eur J. Biochem. 170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本专利技术中，可釆用Lever等的方法来评价玉米稻杆中的纤维素水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定对焚光性二糖衍生物4_甲基伞形基--D-乳糖苷(4_methylumbelliferyl-^ -D-lactoside)的纤维二糖水解酶 I 活性。本专利技术的多肽具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的纤维二糖水解酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%和至少100%。家族6糖苷水解酶术语“家族6糖苷水解酶”或“家族GH6”或“GH6”意指根据 Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities,Biochem. J. 280:309-316,及 Henrissat B.,和 Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases, Biochem. J. 316:695-696属于糖苷水解酶家族6的多妝。纤维素分解酶或纤维素酶术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、￠-葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括(I)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和￠-葡糖苷酶)，如 Zhang 等,Outlook for cellulase improvement: Screening and selectionstrategies, 2006, Biotechnology Advances 24:452-481 所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.06 US 61/258,999;2010.03.04 US 61/310,4301.一种具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其选自下组 (a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID N0:2的成熟多肽具有至少65%同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii) SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链； (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%同一性；和 (d)SEQID N0:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。2.权利要求1的多肽，它包含SEQID NO:2的氨基酸序列或其具有纤维二糖水解酶的片段，或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其具有纤维二糖水解酶活性的片段组成。3.权利要求1的多肽，其由包含于大肠杆菌DSM23379中的质粒pMStrl99所包含的多核苷酸编码。4.一种分离的多核苷酸,其包含编码权利要求1-3任一项的多肽的核苷酸序列。5.—种产生权利要求1-3任一项的多肽的方法,包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下，培养以其野生型形式产生所述多肽的细胞；和(b)回收所述多肽。6.—种产生权利要求1-3任一项的多肽的方法,包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下，培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。7.—种产生亲本细胞的突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-3任一项所述多肽或其部分的多核苷酸，导致所述突变体与亲本细胞相比较产生较少的所述多肽。...
【专利技术属性】
技术研发人员：E弗拉森科，M斯特林格，K施诺尔，B麦克布雷尔，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，诺维信公司，
类型：
国别省市：
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