修饰的APOL1多肽制造技术

本发明专利技术提供了修饰的ApoL1多肽，具体地，在细菌细胞中表达不具有N-末端或f-甲硫氨酸的修饰多肽。还提供了重组生产所述修饰多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】修饰的AP0L1多化 专利
本专利技术提供了修饰的Apo-Ll蛋白。具体地，本专利技术提供了纯化的蛋白、核酸，W及 重组表达该些修饰蛋白的方法。[000引专利技术背景 蛋白在遗传改变的原核细胞中的生物合成导致具有连接至氨基末端的N-甲酯-或末 端甲硫氨酸的蛋白的表达。由于向天然蛋白添加N-甲酯甲硫氨酸可改变其生物活性、构象 稳定性、抗原性等，在可能的情况下，最期望将其除去。 在大肠杆菌（公.co7i)中的蛋白合成通常起始于修饰的氨基酸N-甲酯甲硫氨酸 (fMet)，因此，fMet是大多数蛋白中的N-末端氨基酸。除了极少数例外，N-甲酯基团随后 通过肤去甲酯酶去除，并且依赖于第二个氨基酸的身份，还通过甲硫氨酸氨肤酶（MA巧切 除N-末端甲硫氨酸。特别地，在强过表达的重组蛋白中，fMet去甲酯化可变得不完全，并 且由于fMet是免疫原性的，该会对用于制药目的的蛋白造成问题。 载脂蛋白心1 (Ap化1)是人特异性血清蛋白，其通过在寄生虫的内体膜中形 成离子孔杀死布氏锥虫（化巧><3/7(95〇?<3知ucei)。布氏锥虫罗德西亚亚种化知ucei subspeciesrAo沁siense)和冈比亚亚种（r.知化?eisubspecies脚曲如抵抗该种裂 解活性，并且能够感染人类，导致昏睡症。在布氏锥虫罗德西亚亚种的情况下，对裂解的抗 性设及血清抗性相关（SRA)蛋白与ApoLl的C-末端螺旋的相互作用。正常的人血清（N服） 能够杀死布氏锥虫指名亚种（7： 知ucei)，但不能杀死布氏锥虫罗德西亚亚种和布氏锥 虫冈比亚亚种。 在其分泌前导肤的加工后，人ApoLl具有N-末端氨基酸序列Glu-Glu-Ala-Gly-。 在大肠杆菌中过表达时，由于在第二氨基酸位置的大且带电的谷氨酸，ApoLl保留了在 N-末端的Met(和可能残留的fMet)。 为了在完全去除fMet之外还保持ApoLl的高表达率，需要将肤酶引入宿主细胞系 之外的其他技术。本专利技术通过提供修饰的ApoLl蛋白而满足了该种需求，所述修饰的Ap化1 蛋白在表达时，缺少末端f-Met，同时保持高表达水平。 附图简述 图1显示了W下的5个N-末端氨基酸的序列分析；（图1A)Ap化1 (wt)，由pAVEOl化 表达；（图 1B)ApoLl(A2ins)，由pAVEOl化表达；（图 1C)ApoLl(A2ins)，由pSt油yl. 2 表达；（图ID)ApoLl巧E2del)，ApoLl巧EA2del)，由pSt油yl. 2 表达；和（图IE)ApoLl 巧EA2del)，由pSt油yl.2表达。通过自动化的Edman降解法鉴定氨基酸序列。对每个反应 循环显示确定的氨基酸数量，Wpmol表示，并且突出显示每个循环中的优势氨基酸。 图2显不了由内切蛋白酶Lys-C酶切的ApoLl野生型（图2A)、ApoLlA2ins(图 2B)，和Ap化1EE2del(图2C)的RP-HPLC谱图。指出了对应于N-末端肤片段的峰。显示的 氨基酸序列源自于MS分析。测定的质量对于ApoLl野生型为2502. 15Da(预期为；2502. 54 Da);对于ApoLlA2ins为 2442. 15Da(预期为；2442. 42Da);且对于ApoLl邸 2del为 2113. 03Da(预期为；2113. 13Da)(数据未显示）。 图3显示了在Ap化1的存在下锥虫的生长抑审。将布氏锥虫细胞稀释物与指定量 的ApoLl-起在300W的终体积中在37°C温育20小时的时间段。随后，使用巧光氧化还 原指示剂AlamarBlue测定锥虫的代谢活性。
技术实现思路
本专利技术部分地基于下述发现，即野生型ApoLl的翻译后加工没有完全地除去末端 或f-Met。 本专利技术包括修饰的Apo-Ll多肤，其中所述多肤在重组表达时缺少N-末端甲硫氨 酸（Met)或甲酯甲硫氨酸。在某些实施方式中，所述多肤包含插入在N-末端Met和相邻的 残基之间的氨基酸残基，包括插入在N-末端Met和所述相邻的残基之间的丙氨酸残基。在 进一步的实施方式中，所述相邻的残基是谷氨酸残基。本专利技术提供了修饰的Apo-Ll多肤， 其包含SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 4的氨基酸序列。 在另一个实施方式中，所述修饰的Apo-Ll多肤包含与N-末端Met相邻的至少一 个氨基酸残基的缺失。在可选的实施方式中，所述修饰的Apo-Ll包含与N-末端Met相邻的 至少两个氨基酸残基的缺失，其中所述相邻的残基为谷氨酸。本专利技术提供了修饰的Ap化1 多肤，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。在可选的实施方式中，所述修饰的Apo-Ll包含 与N-末端Met相邻的至少S个氨基酸残基的缺失，其中所述相邻的残基为两个谷氨酸，和 一个丙氨酸。本专利技术提供了修饰的Apo-Ll多肤，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在 某些实施方式中，所述修饰的ApoLl多肤由细菌细胞重组表达，所述细菌细胞包括大肠杆 菌细胞。 本专利技术提供了编码修饰的Apo-Ll多肤的分离的核酸，其包含选自SEQIDNOs: 1、 3、5和7的核酸序列。还提供了包含选自SEQIDNOs: 1、3、5和7的核酸的表达载体，和包 含所述表达载体的宿主细胞。 本专利技术进一步提供了产生多肤的方法，包括；在表达所述核酸序列的条件下在培 养基中培养所述宿主细胞，从而产生所述修饰的Apo-Ll多肤；和从所述宿主细胞或培养基 回收所述修饰的Apo-Ll多肤。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞是细菌细胞，包括大 肠杆菌细胞。[001引专利技术详述 除非文中另有清楚指明，如本文，包括后附的权利要求书中使用的，单数形式的词语， 例如"一"（"a, " "an,"和"the,")包括其相应的复数指代形式。 本文中引用的所有文献均通过引用并入本文，达到如具体且单独地指出每个单独 的出版物、专利申请或专利被通过引用并入本文的相同程度。 I.定义。/虹g蛋白]，或/虹g蛋 白]]等。"载脂蛋白L1"或"Ap化1"是指编码人载脂蛋白L1的基因，或者蛋白Ap化1。Ap化1 是分泌的高密度脂蛋白，其结合载脂蛋白A-I。载脂蛋白A-I是相对丰富的血浆蛋白，并且 是皿L的主要脱辅蛋白质。"多肤片段"是指多肤（例如，ApoLl多肤，抗ApoLl抗体或ApoLl括抗剂（例如，Ap化1-结合多肤，例如SRA)或编码ApoLl多肤、抗ApoLl抗体、ApoLl括抗剂（例如SRA) 或反义ApoLl分子的核酸分子）的一部分，其具有与参照蛋白或核酸的一部分基本相同的 区域，并且保持所述参照蛋白或核酸的至少50%或75%，更优选80%、90%或95%，或甚至99% 的至少一种生物活性，但不包括全长多肤或核酸分子的全部氨基酸或核酸序列。例如，相对 于全长多肤或核酸分子（例如，ApoLl多肤，抗ApoLl抗体或ApoLl括抗剂（例如SRA)或编 码ApoLl多肤、抗ApoLl抗体、ApoLl括抗剂（例如SRA)或反义ApoLl分子的核酸分子）， 所述片段可具有少至少1个，至少5个，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个，或更 多（例如，多至200、300个或更多）的氨基酸残基或核酸碱基。本文档来自技高网...

【技术保护点】
修饰的Apo‑L1多肽，其中所述多肽在重组表达时缺少N‑末端甲硫氨酸(Met)或甲酰甲硫氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M霍恩，Z刘，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：美国;US