多肽的修饰制造技术

本发明专利技术提供一种在离子交换树脂上进行的用于将展示于遗传展示系统的肽缀合于分子支架的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及生产具有期望的结合活性的多肤配体的方法。特别地，本专利技术设及多 肤的生产，所述多肤共价结合于分子支架，从而两个或更多肤环在支架的附着点之间相对。 分子支架与多肤的附着在纯化树脂上进行，纯化树脂可W为磁性树脂珠粒的形式。
技术介绍
环肤能够W高亲和性结合并特异性地祀向蛋白祀标，因而是用于治疗开发的有 吸引力的分子类型。实际上，数个环肤已经成功用于临床，例如，抗菌肤万古霉素，免疫抑 制药物环抱霉素或抗癌药物奥曲肤（ocreotide)值riggers等人，化tRevDrugDiscov 2008, 7 (7)，608-24)。良好的结合特性来自肤和祀标之间形成的相对大的相互作用表面， W及降低的环状结构构象柔性。通常，大环结合数百平方埃的表面，例如，环肤CXCR4括抗 剂CVX15 ( 400A: ;Wu，B.等人，Science330 化007)，1066-71)，结合整合素aVb3 的具有 Arg-Gly-Asp基序的环肤（355A2 )狂iong,J.P.等人，Science2002, 296 巧565)，151-5)、 或结合尿激酶型纤溶酶原激活物的环肤抑制剂upain-1 ( 60.;A2 ;Zhao,G.等人，JStruct Biol2007, 160(1)， 1-10)。 由于其环状构型，大环肤比线性肤柔性低，导致了在结合祀标时赌损失较少，得到 了较高的结合亲和性。降低的柔性还导致锁定祀标特异性构象，与线性肤相比增加了结合 特异性。该效果已经被基质金属蛋白酶8(MMP-8)有效的选择性抑制剂例证了，其中当所述 抑制剂的环打开时，失去了对其他MMP的选择性（Cherney,R.J.等人，JMed化em1998， 41 (11)，1749-51)。通过大环化实现的有利的结合特性，甚至在具有一个W上肤环的多环肤 中更显著，例如，在万古霉素、乳酸链球菌肤（nisin)或放线菌素中。 之前不同的研究小组将带有半脫氨酸残基的多肤连接至合成的分子结构上 (Kemp,D.S和McNamara,P.E. ,J.Org.Qiem, 1985Jimmerman,P.等人，QiemBioQiem, 200f5)。 Meloen和合作者使用S(漠甲基）苯和相关分子将多个肤环快速且定量地环化至合成的支 架上，用于蛋白表面的结构化模拟（Timmerman,P.等人，ChemBioChem,200f5)。生成候选药 物化合物的方法公开于W02004/077062和W02006/078161中，其中通过将含有半脫氨酸的 多肤连接至例如=(漠甲基）苯的分子支架生成所述化合物。 阳0化]W02004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。特别地，该文献公开了包括第 一和第二反应基团的各种支架分子，W及使所述支架与另外的分子接触，来在偶联反应中 在支架和另外的分子之间形成至少两个连接。 W02006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和模拟肤。该文献公开了来 自现有蛋白的肤的各种集合的人工合成。之后将运些肤与恒定的合成肤组合W生成组合文 库，其中恒定的合成肤具有某些引入的氨基酸改变。通过由化学连接将运种多样性引入来 区分W各种氨基酸改变为特征的肤，为发现期望的结合活性提供了增加的机会。该文献的 附图1显示了各种环肤构建体的合成的示意图。该文献中公开的构建体依赖-甜功能化肤， 典型地包含半脫氨酸残基，和支架上的杂芳基，典型地包含苄基面素取代基如二-或=-漠 苯基苯。运样的基团发生反应，在肤和支架之间形成硫酸连接。 化inis等人最近开发了基于隧菌体展示的组合方法，来产生和筛选兴趣祀标的双 环肤的大文库化einis等人，化t化emBiol2009,5(7)，502-7;也可参见国际专利申请 W02009/098450)。简言之，将线性肤的组合文库在隧菌体上展示，其中线性肤含有=个半脫 氨酸残基和六个随机氨基酸（切S-狂aa)6-切S-狂aa)6-切S)的两个区域，并通过半脫氨酸 侧链共价连接至小分子（=(漠甲基）苯）进行环化。在对人蛋白酶组织蛋白酶G和血 浆激肤释放酶（PK)的亲和性选择中，分离的双环肤具有纳摩尔级的抑制常数。最好的抑 制剂PK15W3nM的Ki抑制人PK化PK)。在数个分离双环肤的氨基酸序列中的相似性表明 两个肤环均有助于结合。在最高测试浓度（10yM)下，PK15既不抑制大鼠PK(81%序列 同一性），也不抑制同源的人类丝氨酸蛋白酶因子XIa化巧la;69%序列同一性）或凝血酶 (36%序列同一性HHeinis等人，化tChemBiol2009,5(7)，502-7)。运一发现表明双环 抑制剂拥有对其祀标高度的亲和性，并且是高度特异的。 尽管化inis等人公开的方法对于展示的多肤配体的修饰来产生双环肤是有效 的，但其效率非常低。例如，W每初始隧菌体颗粒350分之1的比例生成感染性隧菌体。因 此我们开发了一种改进的方法，用于修饰遗传展示系统上展示的多肤配体。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种方法，用于将遗传展示系统上展示的肤与分子支 架缀合，包括步骤： (a)将在遗传展示系统上展示的多肤与纯化树脂相组合，使得展示系统结合树脂， 并用还原剂处理结合的展示系统； 化）使结合的展示系统接触分子支架； (C)从结合的展示系统中去除未反应的分子支架；W及 (d)从纯化树脂上洗脱展示系统。 化inis等人的原始方法在自由溶液（化eesolution)中实施肤和分子支架 (TBMB)的缀合。之后通过离屯、分离携带有缀合于（或未缀合）TBMB支架的肤的隧菌体。通 过将隧菌体缀合于固相纯化树脂，我们获得了改进的结果，纯化树脂之后可用于分离隧菌 体。例如，该树脂可W通过离屯、分离，或保留在柱子中；在一个优选的实施方式中，该树脂是 磁性的并且可W通过施加磁场来分离。 化inis等人使用无二硫化物隧菌体（disul地ide-化ee地age)获得了更好的肤 和分子支架（TBMB)缀合结果。使用本文所述的技术，通过将多肤缀合于野生型pin外壳蛋 白使得其展示在隧菌体颗粒上，我们获得了改进的结果，比化inis等人获得的结果更好。 虽然野生型pin受制于在将分子支架偶联于多肤的步骤中使用的还原剂造成的 二硫键降解，我们发现相比于无二硫化物隧菌体，携带野生型pin的隧菌体的增强的感染 性大大弥补了二硫键降解造成的任何活性损失。 优选地，多肤通过融合于fd隧菌体（如fd-tet隧菌体）的pin蛋白上来展示。 在实施方式中，遗传展示系统选择自隧菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展 示和细菌展示。在一个实施方式中，遗传展示系统是隧菌体展示。 在一个实施方式中，在加入分子支架前，紧随步骤（a)的是洗涂步骤。例如，可W 用还原剂的溶液进行洗涂，例如步骤（a)中使用的还原剂。有利地，洗涂步骤中使用的还原 剂比步骤（a)中使用的还原剂不那么强或更稀。 优选地，包括低于500mM，优选低于200mM，有利地低于lOOmM浓度的步骤（a)中所 用的还原剂。例如，还原剂存在的浓度为lOmM或更低，如ImM。 阳〇2U 优选地，包括低于500iiM，优选低于200iiM，有利地低于100iiM浓度的步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将展示于遗传展示系统的肽缀合于分子支架的方法，包括步骤：(a)将展示于遗传展示系统的多肽与纯化树脂组合，使得展示系统结合于树脂并用还原剂处理结合的展示系统；(b)使结合的展示系统接触分子支架；(c)从结合的展示系统去除未反应的分子支架；和(d)从纯化树脂洗脱展示系统。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·斯泰斯，E·沃克，
申请(专利权)人：拜斯科医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB