本发明专利技术提供在细胞培养物中大规模生产蛋白质和/或多肽的改良系统，特别是在具有下列一项或多项特征的培养基中：i)累积氨基酸浓度大于约70mM；ii)累积谷氨酰胺与累积天冬酰胺的摩尔比率小于约2；iii)累积谷氨酰胺与累积总氨基酸的摩尔比率小于约0.2；iv)累积无机离子与累积总氨基酸的摩尔比率为约0.4至1；或v)谷氨酰胺与天冬酰胺的组合累积浓度在约16mM和36mM之间。此类系统的应用使能够产生高水平的蛋白质，并减少某些不良因子如铵盐和/或乳酸盐的蓄积。此外，(本发明专利技术)还提供了包括温度改变的培养方法，通常包括当培养物达到其最大细胞密度约20-80%时降低温度。备选地或额外地，本发明专利技术提供了使培养物中乳酸盐和/或铵盐水平达到峰值后降低的方法。
【技术实现步骤摘要】
多肽的生产本申请是申请日为2005年8月26日的、专利技术名称为“多肽的生产”的中国专利申请 200580036899. I (PCT/US2005/030437)的分案申请。相关申请本申请要求于2004年8月27日递交的临时专利申请号60/605，097,60/604, 941和60/605，074的优先权，均在此处整体引用作为參考。
技术介绍
蛋白质和多肽作为治疗物质已日益重要。大多数情况下，治疗性蛋白质和多肽产生于细胞培养物中，所述细胞经过基因工程操作和/或选择以产生非比寻常的高水平特定目的蛋白质或多肽。细胞培养条件的调控和优化对于蛋白质和多肽的成功商业化生产至关 重要。许多在细胞培养物中生产的蛋白质和多肽均系分批或补料分批方法产生，其中将细胞培养一段时间，然后終止培养并分离产生的蛋白质或多肽。细胞培养条件能显著影响所产生蛋白质或多肽的最終数量和质量。例如，常规分批或补料分批培养方法常常导致产生对细胞増殖、存活力以及目的蛋白质和多肽的产生或稳定性有不良影响的代谢废物。尽管已经努力改善分批或补料分批培养方法中蛋白质和多肽的生产，仍然有进ー步改进的需要。此外，也投入了大量的精力以发展用于培养细胞(特别是哺乳动物细胞)的限定培养基(即由已知单个成分组合的、缺乏血清或其他动物性副产物的培养基)。细胞在限定培养基中的生长特性相对于血清来源培养基中可能有很大差别。尤其需要发展出在限定培养基的细胞培养物中产生蛋白质和多肽的改良系统。专利技术概述本专利技术提供了在细胞培养物中大規模生产蛋白质和/或多肽的改良系统。例如，本专利技术提供了利用培养基进行商业规模(如500L或更多)培养的方法，所述培养基具有下列ー项或多项的特征i)每单位体积中累积氨基酸量大于约70mM;ii)累积谷氨酰胺与累积天冬酰胺的摩尔比率小于约2 ;iii)累积谷氨酰胺与累积总氨基酸的摩尔比率小于约O. 2 ；iv)累积无机离子与累积总氨基酸的比率为约O. 4至I ;或V)每单位体积谷氨酰胺与天冬酰胺浓度的组合累积量大于约16mM。本领域普通技术人员理应知道上文所用的“累积”是指，在细胞培养过程中加入的特定成分的总量，包括在培养起始时加入的成分以及其后加入的成分。在本专利技术的某些优选实施方案中，期待将培养期间的“补料”減少到最小，因此需要最大化培养起始时的量。当然培养基成分在培养期间被代谢，因此如果在不同时间加入某些成分(例如全部于起始时加入和ー些通过补料加入)，则特定成分累积量相同的培养基的绝对水平会有所差异。根据本专利技术，此类培养基的应用能提高蛋白质产生的水平，并减少某些不良因子如铵盐和/或乳酸盐的蓄积。本领域的普通技术人员知道，本专利技术的培养基配方包括限定和非限定培养基。在本专利技术的某些优选实施方案中，培养基为成分已知并受控的限定培养基。在本专利技术的某些优选实施方案中，培养方法包括将第一组培养条件变为第二组培养条件，从而改变细胞的代谢。在某些实施方案中，当培养物达到其最大细胞密度约20-80%时实施这ー改变。在某些实施方案中，所述改变包括改变培养物的維持温度(或温度范围)。备选地或额外地，本专利技术提供了调整的方法，以使培养物中乳酸盐和/或铵盐水平在达到峰值后随时间而下降。在其他实施方案中，所述改变包括改变PH值、摩尔渗透压浓度或化学物诱导物如链烷酸或其盐的水平。本专利技术的细胞培养物可任选添加营养素和/或其他培养基成分，包括激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯、钙、镁和磷)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(终浓度通常极低的无机化合物)、氨基酸、脂质或葡萄糖或其他能源。在本专利技术的某些实施方案中，向培养基中添加化学诱导物如六亚甲基ニこ酰胺(“HMBA”)和丁酸钠(“NaB”)是有利的。这些任选增补剂可在培养起始时加入，或者稍后加入以补充消耗的营养素或以备他用。一般而言，期望根据本专利技术需要选择初始培养基成分以使添加降至最低。可监测本专利技术的多种培养条件，包括pH、细胞密度、细胞存活力、乳酸盐水平、铵盐水平、摩尔渗透压浓度或表达的多肽或蛋白质的滴度。 附图简述图I显示了利用抗⑶F-8细胞对摇瓶中培养基I和培养基2的比较。图2显示了培养基I中抗⑶F-8细胞的细胞生长和存活力。图3显示了抗⑶F-8细胞培养物在对照和无谷氨酰胺补料培养条件下的细胞生长。图4显示了抗GDF-8细胞培养物在对照和无谷氨酰胺补料培养条件下的细胞存活力。图5显示了抗⑶F-8细胞培养物在对照和无谷氨酰胺补料培养条件下的铵盐水平。图6显示了抗⑶F-8细胞培养物在对照和无谷氨酰胺补料培养条件下的乳酸盐水平。图7显示了在对照和无谷氨酰胺补料培养条件下的抗⑶F-8滴度。图8显示了抗GDF-8细胞培养物在对照和谷氨酰胺饥饿的补料培养条件下的细胞山I又O图9显示了抗GDF-8细胞培养物在对照和谷氨酰胺饥饿的补料培养条件下的细胞存活力。附图说明图10显示了抗⑶F-8细胞培养物在对照和谷氨酰胺饥饿的培养条件下的铵盐水平。图11显示了抗⑶F-8细胞培养物在对照和谷氨酰胺饥饿的培养条件下的乳酸盐水平。图12显示了在对照和谷氨酰胺饥饿的培养条件下的抗⑶F-8滴度。图13显示了培养基I和培养基2中抗⑶F-8细胞的铁剂量应答。图14显示了补充了谷氨酸和谷氨酰胺的培养物中的细胞密度。图15显示了补充了谷氨酸和谷氨酰胺的培养物中的细胞存活力。图16显示了补充了谷氨酸和谷氨酰胺的培养物中的抗Lewis Y滴度。图17显示了补充了谷氨酸和谷氨酰胺的培养物中的乳酸盐水平。图18显示了补充了谷氨酸和谷氨酰胺的培养物中的铵盐水平。图19显示了补充了谷氨酸和谷氨酰胺的培养物的摩尔渗透压浓度。图20显示了抗Lewis Y细胞的细胞密度。每一曲线为相同条件下生长的两只摇瓶的平均值。图21显示了抗Lewis Y细胞的细胞存活力。每一曲线为相同条件下生长的两只摇瓶的平均值。图22显示了抗Lewis Y培养物的平均滴度。每一曲线为相同条件下生长的两只摇瓶的平均值。图23显示了抗Lewis Y细胞的铵盐水平。每一曲线为相同条件下生长的两只摇 瓶的平均值。图24显示了补料分批培养中所用的叶轮窜动。图25显示了多种试验条件下抗⑶F-8细胞的细胞生长。图26显示了多种试验条件下抗⑶F-8细胞的存活力。图27显示了多种试验条件下的抗⑶F-8滴度。图28显示了多种试验条件下抗⑶F-8培养物的乳酸盐水平。图29显示了多种试验条件下抗⑶F-8培养物的铵盐水平。图30显示了多种试验条件下抗⑶F-8细胞的细胞生长。图31显示了多种试验条件下的抗⑶F-8滴度。图32显示了多种试验条件下抗⑶F-8培养物的乳酸盐水平。图33显示了多种试验条件下抗⑶F-8培养物的铵盐水平。图34显示了在含不同水平谷氨酰胺和天门冬酰胺的改良培养基9中抗GDF-8细胞的细胞生长。图35显示了在含不同水平谷氨酰胺和天门冬酰胺的改良培养基9中抗GDF-8细胞的细胞存活力。图36显示了在含不同水平谷氨酰胺和天门冬酰胺的改良培养基9中抗GDF-8培养物的乳酸盐水平。图37显示了在含不同水平谷氨酰胺和天门冬酰胺的改良培养基9中抗GDF-8培养物的铵盐水平。图38显示了在不同水平含谷氨酰胺和天门冬酰胺的改良培养基9中抗GDF-8培养物的谷氨酰胺水平。图39显示了含不同水平谷氨酰胺和天门冬酰胺的改良本文档来自技高网...
【技术保护点】
在大规模生产细胞培养物中生产多肽的方法，包括步骤：提供细胞培养物，其包括；含有目的多肽编码基因且该基因可在细胞培养条件下表达的哺乳动物细胞；以及含有谷氨酰胺的培养基，其具有选自以下的培养基特征及其组合：(i)每单位体积中累积氨基酸量大于约70mM，(ii)累积谷氨酰胺与累积天冬酰胺的摩尔比率小于约2，(iii)累积谷氨酰胺与累积总氨基酸的摩尔比率小于约0.2，(iv)累积无机离子与累积总氨基酸的摩尔比率为约0.4至1，(v)每单位体积谷氨酰胺与天冬酰胺的组合累积量大于约16mM；将所述培养物在起始生长阶段的第一组培养条件下维持足够长的第一段时间，以使所述细胞增殖至活细胞密度达到所述培养物在此第一组培养条件下可达到的最大可能活细胞密度的20%？80%范围；改变至少一个培养条件，从而应用第二组培养条件；将所述培养物在第二组培养条件下维持第二段时间，使多肽在细胞培养物中累积。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·德拉波，YT·卢安，J·R·梅瑟，W·王，D·R·拉斯科，
申请(专利权)人：辉瑞爱尔兰药品合伙公司，
类型：发明
国别省市：
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