长胰岛素样生长因子1突变体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于哺乳动物细胞培养用的长胰岛素样生长因子1突变体(LongR3IGF-1)的制备方法，其特点是先进行含有LongR3IGF-1基因的工程菌在全合成培养基中发酵，收集菌体并将菌体裂解，收集包含体并用尿素变性剂进行溶解，然后酶切获得变性的LongR3IGF-1蛋白，经稀释复性形成有活性蛋白，再通过离子交换层析获得有生物活性的LongR3IGF-1纯品。采用本发明专利技术方法制备的LongR3IGF-1具有完整的生物学活性，蛋白纯度达到95％以上，内毒素含量低，适合于哺乳动物细胞培养使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组蛋白，具体涉及长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的制备方法。
技术介绍
按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。如今哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台，如抗体、生长因子、凝血因子、疫苗等。哺乳动物细胞培养基不仅需要提供适合于细胞生长必需的营养成份和适合的环境，而且还需要添加能够刺激细胞生长、繁殖的各种生物活性物质，如动物血清，其中最常 用的就是牛血清。但由于对动物源性病毒引入的担心，特别是疯牛病、猪流感、人克雅氏病等疾病的发生，FDA、EMBA、CBER等权威机构都建议生物制药企业使用无动物源性成份的培养基。除了对动物源性材料可能携带病毒的担忧，由于动物血清中成份的复杂,往往也给下游目标产品的纯化带来很大的难度，严重影响了产品生产的产率和效率。而无血清培养基中的成份相对比较明确，添加的外源蛋白相对较少，利于后续的产品的分离纯化。在无血清培养基中，胰岛素和转铁蛋白是最重要的两种蛋白生长因子。胰岛素可刺激细胞的生长、抑制细胞凋亡；促进蛋白质、脂肪酸和糖原合成等胰岛素反应，是重要的细胞存活因子。胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF-2)是一种促进有丝分裂和合成代谢的多肽，在结构上与胰岛素相类似。并且胰岛素受体(IR)和胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)的氨基酸序列和蛋白结构也具有相似性。从而胰岛素和IGF-I都能与对方的受体相结合，但其亲和力相对较低。众所周知，在无血清细胞培养基中，胰岛素所表现出来的生物学效应都是通过其与IGF-IR结合介导产生的。事实上在制药工业应用最广泛的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表面只表达很少IGF-1R，另外由于胰岛素与IGF-IR亲和性相对较弱，使得需要添加很高浓度胰岛素(超生理浓度)才能表现出其促进细胞生长、抑制细胞凋亡等效应。虽然IGF-I能直接与哺乳动物细胞表面的IGF-IR结合并产生生物学效应，但是哺乳动物细胞能持续分泌一种能与IGF-I相结合的蛋白-IGF结合蛋白(IGFBP)，IGFBP通过与IGF-I结合阻碍了 IGF-I与其受体结合，从而抑制了 IGF-I的生物学效应。长胰岛素样生长因子I突变体(LongR3IGF-l)是IGF-1的类似物，与IGFR高亲和结合并产生生物学效应。LongR3IGF-l通过对IGF-I个别的氨基酸突变，并在N端延长了氨基酸序列，极大的降低了 LongR3IGF-l与IGFBP的亲和性(大于1000倍)，确保了其在培养基中发挥长期稳定的生物学效应。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种高纯度、适合于哺乳动物细胞培养用的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案一种具有SEQ ID NO. I所示氨基酸序列的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法，包括下列步骤a)在发酵罐中接种含有长胰岛素样生长因子I突变体基因的基因工程菌；b)发酵罐中发酵培养和表达含有长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的融合蛋白，离心收集菌体；c)含有长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的融合蛋白的分离纯化，酶切获得长胰 岛素样生长因子I突变体蛋白；d)长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的复性和精纯化。在步骤a)中，所述的基因工程菌是具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的大肠杆菌。在步骤b)中，所述发酵罐中发酵培养所采用的发酵培养基为全合成培养基，不含动物源性材料。在步骤b)中，所述的全合成培养基，其主要组成成份为葡萄糖40g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二铵4g/L，柠檬酸I. 7g/L和氢氧化钠2g/L。步骤b)具体为发酵罐中37°C发酵培养使细菌密度0D600达到20，然后加入IPTG诱导表达目标蛋白，诱导3小时后结束培养，离心收集菌体。步骤c)具体为通过细胞破碎获得含有长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的融合蛋白的包含体，溶解包含体后酶切获得变性的长胰岛素样生长因子I突变体蛋白。步骤c)中，所述溶解包含体后酶切具体为包含体用尿素变性剂进行溶解，离心包含体溶解液，取上清液透析，取透析液加入重组肠激酶37°C水浴中消化酶切4小时，然后经阴离子交换层析，收集流出峰，获得变性的长胰岛素样生长因子I突变体蛋白。步骤d)具体为通过变性的长胰岛素样生长因子I突变体蛋白稀释复性获得有生物活性的蛋白，再经过阳离子交换层析获得高纯度的长胰岛素样生长因子I突变体蛋白。在步骤d)中，所制备的长胰岛素样生长因子I突变体蛋白具有完全的生物学活性，蛋白纯度大于95%，细菌内毒素小于lEU/ug。本专利技术的技术方案要点体现在以下几方面I、本专利技术采用融合表达策略，提供了长胰岛素样生长因子I突变体获得高效表达的方法。长胰岛素样生长因子I突变体是含有83个氨基酸残基，分子量为9. IKd,属于分子量较小的蛋白质多肽。而分子量较小的蛋白由于在大肠杆菌中容易被宿主蛋白酶识别并降解，导致产物不稳定，表达量往往比较低。在大肠杆菌中蛋白的稳定性可随着分子量的增大而增加，所以小分子多肽与宿主蛋白融合表达有利于提高多肽的稳定性而提高表达量。根据长胰岛素样生长因子I突变体的分子量和其等电点较高的特性，选择硫氧还蛋白(Thioredoxin)作为融合蛋白比较适合。硫氧还蛋白分子量为17Kd左右,在提高融合蛋白的稳定性的情况下保证了目的蛋白的在融合蛋白中的含量。另外硫氧还蛋白的等电点为4. 9，利于融合蛋白的表达和后期的分离。此外，硫氧还蛋白是大肠杆菌中自身的高表达蛋白，进一步利于融合蛋白的表达。2、本专利技术中采用全合成培养基发酵表达，提供了无动物源性材料的发酵表达长胰岛素样生长因子I突变体的方法。大肠杆菌发酵中通常采用含蛋白胨、酵母提取物等原料的营养丰富、成份复杂的培养基，大肠杆菌在这种培养基中生长迅速，重组蛋白也能得到较好的表达。但是由于蛋白胨是牛奶中酪蛋白的水解物，酵母提取物中成份复杂，与FDA、EMBA、CBER等权威机构建议生物制药企业使用无动物源性成份的培养基相违背。本专利技术中采用全合成培养基，其方法为葡萄糖40g，磷酸二氢钾15g，磷酸氢二铵 4g，柠檬酸I. 7g溶解到I升去离子水中，用氢氧化钠调节pH到6. 8 (约2g/L)，120°C高压灭菌20分钟。冷却后加入4mM硫酸镁和I毫升微量元素添加剂。本专利技术中采用的全合成培养基不含蛋白胨、酵母提取物等动物源性材料。3、本专利技术提供了长胰岛素样生长因子I突变体的分离纯化方法。离心收集菌体，称重。菌体以Ig IOml的比例重悬浮于破菌缓冲液(20mMTrisHCl、300mMNaCl、lmM EDTA、pH 7.5)中，用高压均质机在 800Bar_1200Bar 的压力下冰浴破碎2次使菌体完全破碎，6000RPMX 10分钟离心收集沉淀。称取沉淀，沉淀以Ig IOml的比例重悬浮于包含体洗涤液中(20mM TrisHCl,300mM NaClUmM EDTA、3M 尿素、pH 7. 5)，400W 冰浴超声 10 分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有如SEQ？ID？NO.1所示氨基酸序列的长胰岛素样生长因子1突变体的制备方法，包括下列步骤：a)在发酵罐中接种含有长胰岛素样生长因子1突变体基因的基因工程菌；b)发酵罐中发酵培养和表达含有长胰岛素样生长因子1突变体蛋白的融合蛋白，离心收集菌体；c)含有长胰岛素样生长因子1突变体蛋白的融合蛋白的分离纯化，酶切获得长胰岛素样生长因子1突变体蛋白；d)长胰岛素样生长因子1突变体蛋白的复性和精纯化。

【技术特征摘要】
1.一种具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法，包括下列步骤 a)在发酵罐中接种含有长胰岛素样生长因子I突变体基因的基因工程菌； b)发酵罐中发酵培养和表达含有长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的融合蛋白，离心收集菌体； c)含有长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的融合蛋白的分离纯化，酶切获得长胰岛素样生长因子I突变体蛋白； d)长胰岛素样生长因子I突变体蛋白的复性和精纯化。2.如权利要求I所述的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法，其特征在于，在步骤a)中，所述的基因工程菌是具有SEQID NO. 2所示核苷酸序列的大肠杆菌。3.如权利要求I所述的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法，其特征在于，在步骤b)中，所述发酵罐中发酵培养所采用的发酵培养基为全合成培养基，不含动物源性材料。4.如权利要求3所述的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法，其特征在于，在步骤b)中，所述的全合成培养基，其主要组成成份为葡萄糖40g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二铵4g/L，柠檬酸I. 7g/L和氢氧化钠2g/L。5.如权利要求I所述的长胰岛素样生长因子I突变体的制备方法，其特征在于，步骤b)具体为发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖远平，史瑾，丁剑锋，张燕，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：