生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学、基因组学以及生物技术领域，特别是涉及生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC

【技术实现步骤摘要】
生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC
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seq产物中的用途及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学、基因组学以及生物
，特别是涉及生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC
‑
seq产物中的用途及方法。

技术介绍

[0002]染色质靶向切割和标签化（Cleavage under target and tagment, CUT&Tag）是近年兴起的一种新型蛋白质
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染色质相互作用研究方法，该方法结合了转座
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可及染色质实验（Assay for Targeting Accessible
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Chromatin with high
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throughout sequencing，ATAC
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seq）和染色质核酸酶靶向切割和释放策略（Cleavage under target and release under nuclease, CUT&RUN）的特点，利用protein A/protein G融合Tn5的融合蛋白，通过protein A/G
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抗体相互作用将转座体栓系在靶抗体周围的区域，从而实现目标特异性的片段化反应。相比于传统的ChIP
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seq，CUT&Tag操作相对简单、无需甲醛交联、信噪比较高、所需测序量少且适用于极低起始量和单细胞的应用场景。CUT&Tag和ATAC
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seq所使用的转座体需要加入SDS失活，体系中存在的SDS会干扰后续的PCR反应，因此必须进行DNA提取或利用其他方法消除SDS的干扰。现有的CUT&Tag/ATAC
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seq产物回收或后续处理方法主要包括酚氯仿抽提
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乙醇沉淀法，片段分选（Solid
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phase reversible immobilization, SPRI）磁珠回收法、离心柱回收法和直接PCR法，其中酚氯仿抽提
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乙醇沉淀法操作繁琐、耗时长、效率相对低下；SPRI beads回收法会损失小于150bp的片段，从而造成信号的损失；离心柱回收法需要高质量的离心柱，增加了耗材成本；而直接PCR法则在部分抗体上会损失大于300bp的片段，并且建库效果受到扩增酶和延伸时间的影响较大。现有的CUT&Tag产物回收/后续处理方法均存在各自的缺陷，影响了CUT&Tag技术更广泛的应用，所以建立一种通用型的便捷、快速、无底物损失的CUT&Tag/ATAC
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seq产物回收方法就显得非常必要。

技术实现思路

[0003]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC
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seq产物中的用途及方法，用于解决现有技术中的问题。
[0004]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC
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seq产物中的用途，所述生物素化的转座体选自携带有转座酶的融合蛋白与能和转座酶结合的生物素化接头
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末端复合体形成的生物素化的转座体，和/或，转座酶与生物素化接头
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末端复合体结合形成的生物素化的转座体；所述携带有转座酶的融合蛋白中还包括具有结合抗体Fc段功能的蛋白，所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自Protein A、Protein G或Protein L中的两种以上。
[0005]本专利技术还提供一种与靶蛋白结合的片段化核酸产物的回收方法，所述回收方法包括以下步骤：1）选自以下任一：
1a）将细胞核或透化的细胞与抗体和生物素化的转座体共同孵育；通过抗体引导的生物素化的转座体进行酶切反应并产生含有接头序列的片段；1b) 将细胞核或透化的细胞与生物素化的转座体共同孵育；通过生物素化的转座体直接进行酶切反应并产生含有接头序列的片段；2）将步骤1）中所加入的生物素化的转座体失活，使得生物素化的片段被释放至溶液上清中；3）再加入链霉亲和素磁珠，回收得到与靶蛋白结合的片段化核酸产物。
[0006]如上所述，本专利技术的生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC
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seq产物中的用途及方法，具有以下有益效果：本申请通过对CUT&Tag或ATAC
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seq中转座体的接头序列生物素化，产生的生物素化的核酸产物能够被链霉亲和素磁珠结合，链霉亲和素磁珠回收仅仅需要20分钟的室温孵育时间就能和全部生物素化DNA结合，洗涤后可直接PCR制备NGS文库。通过对回收效率和文库分布的检测，发现本申请提供的回收方法在便捷快速的同时具有更高的产物回收效率，并且没有明显因为片段偏好性带来的底物损失。降低了操作难度，提高了回收效率，特别适用于少量细胞微量DNA产出的回收场景。
附图说明
[0007]图1显示为CUT&Tag产物回收方法示意图。
[0008]图2显示为普通pAG
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Tn5与生物素化的pAG
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Tn5标签化反应对比。
[0009]图3显示为生物素化的片段化产物在孵育链霉亲和素磁珠后上清无核酸条带。
[0010]图4显示为生物素化的pAG
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Tn5的CUT&Tag可以得到和普通转座体类似的效果。
[0011]图5显示为不同回收方法得到的CUT&Tag产物的片段分布图。
[0012]图6显示为SPRI beads回收CUT&Tag产物和biotin adaptor
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pAG
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Tn5（即SA beads）回收CUT&Tag产物在HPRT1基因上的分布，以及biotin adaptor
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pAG
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Tn5回收CUT&Tag产物中不同大小片段对结果的贡献。
[0013]图7显示为SPRI beads、乙醇沉淀
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酚氯仿抽提（即ET）、直接PCR法（即D
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PCR）回收CUT&Tag产物和biotin adaptor
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pAG
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Tn5（即SA beads）回收CUT&Tag产物在KRAS基因上的分布贡献以及不同SPRI beads回收数据量对结果的影响。
[0014]图8显示为四种不同回收方法在所产生的文库规模大小对比。
[0015]图9显示为不同回收方法得到的ATAC
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seq产物的片段分布图。
[0016]图10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC
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seq产物中的用途，所述生物素化的转座体选自携带有转座酶的融合蛋白与能和转座酶结合的生物素化接头
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末端复合体形成的生物素化的转座体，和/或，转座酶与生物素化接头
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末端复合体结合形成的生物素化的转座体；所述携带有转座酶的融合蛋白中还包括具有结合抗体Fc段功能的蛋白，所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自Protein A、Protein G或Protein L中的两种以上。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述携带有转座酶的融合蛋白为pAG
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Tn5。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述末端选自Mosaic末端。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述生物素化接头
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末端复合体为生物素化的接头A
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末端复合体和/或生物素化的接头B
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末端复合体。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述生物素化接头
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末端复合体由单链接头A
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Mosaic末端正向寡核苷酸和Mosaic末端的反向寡核苷酸退火后形成。7.根据权利要求4所述的用途，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦晔，李科，张清仪，崔利兰，杨庆明，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：