一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测新型冠状病毒COVID‑19的核酸组合物及应用，先基于转录介导的扩增技术（TMA）进行核酸样本扩大，再联合CRISPR‑Cas13a蛋白酶的“连带切割”的活性进行特异性地检测扩大后的病毒靶标核酸。向含有待检靶标核酸的反应体系中加入sgRNA、Cas13a蛋白、ssRNA信号报告探针和反应缓冲液，反应进行时对其信号读取检测，进而得以检测目的基因。使用本发明专利技术的方法可快速检测样品中是否含有靶标核酸序列，且与转录介导的核酸扩增技术的结合，使得该检测方法的灵敏度可以达到纳摩尔级，可适用于快速检测病原微生物、基因突变和特异靶标RNA等。

Nucleic acid composition for novel coronavirus COVID-19 detection and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物及应用
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物及应用。
技术介绍
新型冠状病毒COVID-19自爆发以来，疫情的迅速蔓延，无不牵动着国人的心，也给全国疫情防控承受空前压力，绝大部分省市都进入公共卫生事件一级响应状态。目前，已知的人冠状病毒共有7种，分别是在1965年发现的HCoV-229E，在1967年鉴定出的HCoV-OC43，在2003年在我国广东出现的SARS-CoV，在2004年在荷兰分离鉴定出HCoV-NL63，在2005年在香港筛查出HCoV-HKU1，在2012年在中东地区出现的MERS-CoV，以及在2019年中国武汉发现的新型冠状病毒COVID-19。其中，新型冠状病毒COVID-19是在2019年12月末在湖北省武汉市爆发的一种引起人类呼吸道疾病和严重肺炎等临床症状的可人传人的传染病。截止2020年2月13日，全国已确诊59885人感染该病，疑似病例16067人，导致1368人死亡。国际病毒分类委员会（ICTV）声明，将该新型冠状病毒命名为“SARS-Cov2”(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2)。最新更名为“COVID-19”。冠状病毒是外面包裹着脂肪膜，其膜表面含有刺突糖蛋白、小包膜糖蛋白、膜糖蛋白三种糖蛋白。其内部核酸为长27-31kb的单链RNA，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”构造，3’端有PolyA“尾巴”结构，可以发挥翻译模板作用，而省去了RNA－DNA－RNA的转录过程。也就是说，一般这类病毒颗粒中的遗传物质正链RNA进入寄主细胞，就直接作为mRNA，翻译出所编码的蛋白质，其中包括衣壳蛋白和病毒的RNA聚合酶。在病毒RNA复制酶作用下复制RNA，同时以该RNA为模板合成dsRNA，在不断重复复制和解旋的过程中自我装配成成熟的病毒。其中，核酸检测是目前最可靠的筛查和确认辅助手段，在符合疑似病例标准的基础上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本核酸阳性确诊。由于目前世界上还没有研发出有效的针对该病毒的疫苗，为防止疾病传播疫点内和涉及人员的人员只能被全部隔离，给生产生活各个方面都带来巨大损失。因此，在当前严峻的防控形势下全国亟需要开发一种简便、快速且高灵敏度的鉴别诊断试剂盒，为临床快速确诊新型冠状病毒COVID-19以及其他类似RNA病毒感染提供检测技术。特异性核酸或基因分子检测方法是当代医学发展的重要前沿领域之一，具有的应用价值，如病原体检测、遗传病检测等。通过探究每种病原微生物其独一无二的特征核酸分子序列的存在或变化，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法，也叫核酸诊断(NADs,nucleicaciddiagnostics)。其广泛用于食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染诊断等领域。现有技术多存在诊断时间长、操作复杂、灵敏度低等缺点。复杂多变的诊断环境，限制了基因分子检测技术的应用，同时也对技术的发展提出了挑战。而一种原核生物(如细菌和古细菌等)抵御病毒等外源入侵核酸的获得性免疫系统即：CRISPR-Cas系统，引起基因编辑
发生了革命性突破。其中CRISPR-Cas9特异性识别并切割靶标序列，被广泛开发成基因组编辑工具。2015年张锋团队发现了核酸内切酶Cas12a，与Cas9蛋白相同都是由sgRNA或crRNA引导的特异性切割靶标dsDNA，不同的是Cas12a仅需要crRNA即可引导特异性切割dsDNA，产生粘性末端易于基因编辑。最大的不同在于Cas12a具有在切割靶标dsDNA后会对非特异性任意切割ssDNA的“旁路切割”活性，根据这种特性可以开发出基于CRISPR-Cas12a系统对细胞、血液、唾液、尿液和粪便等样本中病毒DNA进行快速、准确检测的检测体系。上述方法涉及到的Cas9和Cas12检测系统中的靶标模板均为双链DNA，而当前的新型冠状病毒COVID-19核酸为ssRNA。2017年张锋等人发现了新型蛋白Cas13a，该蛋白是VI型CRISPR-Cas系统效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白。特别地，Cas13a在sgRNA的引导下具有识别并特异性切开靶标ssRNA后，仍能保持RNA酶切活性随即不受限制的切割其他非靶标ssRNA（可设计成RNA荧光报告系统）的“连带切割”(collateraleffect)，借助此特性可以针对特定序列的靶标核酸进行检测。张峰等人利用该蛋白的这种特殊切割活性结合RPA技术(recombinasepolymeraseamplification，等温扩增)，建立快速核酸检测技术，该方法称为SHERLOCK(SpecificHighSensitivityEnzymaticReporterUnLOCKing)。由于当前新型冠状病毒形势非常严峻，开发检测新型的冠状病毒工具必须确保具有较高的灵敏度和较强的忠实性，Cas13a-sgRNA可以被靶RNA激活，从而实现体外高灵敏度的RNA检测，并且还要能够实现快速准确报告结果。
技术实现思路
为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物及应用。通过本专利技术制备的检测试剂盒能够在等温条件下进行转录介导的核酸扩增技术，迅速扩大病毒RNA核酸的拷贝数，加之CRISPR-Cas13a结合sgRNA系统切割病毒核酸并且进一步切割荧光淬灭核酸探针的ssRNA产生荧光信号的高特异性检测体系，完善基因分子检测技术，使得痕量、高灵敏度、高特异性且准确的鉴别病毒成为可能。该技术手段除了可以快速鉴别病毒如新型冠状病毒COVID-19、艾滋病病毒、白血病病毒等RNA病毒，也可以运用在疾病筛查与诊断、遗传病、食品卫生检测、法医鉴定、环境污染等各个方面。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术的第一目的提供一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物，包括根据新型冠状病毒COVID-19的N基因序列设计的引物对N-t7F和N-R、以及根据新型冠状病毒COVID-19的Orf1ab基因序列设计的引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R，所述N基因的序列如SEQIDNO:1所示，所述Orf1ab基因的序列如SEQIDNO:2所示；所述引物对N-t7F和N-R的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，所述引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R的序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。作为优选，还包括RNA核酸探针，所述RNA核酸探针为化学合成的两端进行荧光标记修饰的ssRNA核酸探针，所述ssRNA核酸探针的序列如SEQIDNO:9所示，所述ssRNA核酸探针在5’端标记有荧光报告基团，在3’端标记有荧光淬灭基团。作为优选，所述荧光报告基团选自HEX、Cy5、FAM、ROX中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ3、TAMR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物，其特征在于，包括根据新型冠状病毒COVID-19的N基因序列设计的引物对N-t7F和N-R、以及根据新型冠状病毒COVID-19的Orf1ab基因序列设计的引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R，所述N基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述Orf1ab基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物对N-t7F和N-R的序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示，所述引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R的序列如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物，其特征在于，包括根据新型冠状病毒COVID-19的N基因序列设计的引物对N-t7F和N-R、以及根据新型冠状病毒COVID-19的Orf1ab基因序列设计的引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R，所述N基因的序列如SEQIDNO:1所示，所述Orf1ab基因的序列如SEQIDNO:2所示；所述引物对N-t7F和N-R的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，所述引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R的序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。


2.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物，其特征在于，还包括RNA核酸探针，所述RNA核酸探针为化学合成的两端进行荧光标记修饰的ssRNA核酸探针，所述ssRNA核酸探针的序列如SEQIDNO:9所示，所述ssRNA核酸探针在5’端标记有荧光报告基团，在3’端标记有荧光淬灭基团。


3.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自HEX、Cy5、FAM、ROX中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ3、TAMRA中的一种。


4.一种检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1-3任一所述的检测新型冠状病毒COVID-19的核酸组合物。


5.一种非疾病诊断目的的检测新型冠状病毒COVID-19核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据新型冠状病毒COVID-19的序列化学合成N基因和Orf1ab基因片段，经过转染人工制备假病毒，即病毒蛋白和核酸复合物，然后核酸抽提后梯度稀释，稀释后作为转录介导的扩增模板；
S2、根据新型冠状病毒COVID-19的N基因序列设计引物对N-t7F和N-R、以及根据新型冠状病毒COVID-19的Orf1ab基因序列设计引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R，利用转录介导的扩增体系对病毒核酸进行等温扩增以扩大病毒核酸的拷贝数；其中，N基因的序列如SEQIDNO:1所示，Orf1ab基因的序列如SEQIDNO:2所示；引物对N-t7F和N-R的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，引物对Orf1ab-t7F和Orf1ab-R的序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；
S3、根据新型冠状病毒COVID-19的N基因和Orf1ab基因序列的切割靶点，化学合成引导的Cas13a蛋白的sgRNA，其中，N基因靶点对应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王笃强，位小丫，赵曼曼，李瑞霞，郑实，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32