一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒，涉及生物技术领域，其技术方案要点是：对罗非鱼罗湖病毒(TiLV)的ORF10基因设计特异性RPA引物、探针及试剂盒，能够对罗非鱼罗湖病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对罗非鱼养殖、进出口检验检疫具有科学指导意义。

A RPA primer, probe and kit for tilv detection

【技术实现步骤摘要】
一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及生物
，更具体地说，它涉及一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒。
技术介绍
罗非鱼是全球重要淡水养殖经济鱼种之一，可进行高密度养殖，是发展中国家动物性蛋白质的重要来源。罗非鱼原产非洲，属热带性鱼类，罗非鱼属包括亚种共有100多种。罗非鱼具有生长快、产量高、食性杂、繁殖力强等特点。目前，我国罗非鱼的养殖主要集中在广东、广西、海南等热带、亚热带地区，以池塘精养为主。罗非鱼除了内销外，还可以制作成鱼片、鱼排等出口国外，是我国南方渔民重要经济来源之一。与其他鱼类比较，罗非鱼曾以易养殖和抗病力强著称。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发与病毒有关的养殖罗非鱼和野生罗非鱼大量死亡事件，给罗非鱼养殖业造成了重大经济损失。经研究，发现引起罗非鱼大量死亡的病原均为罗湖病毒(Tilapialakevirus，TiLV)，是一种负链RNA病毒，基因组由10个独立的基因片段组成。目前，国际病毒分类委员会(ICTV)第十次病毒分类报告里将TiLV单独列为罗非鱼病毒属的罗非鱼病毒种。2017年5月，世界动物卫生组织(OIE)、联合国粮农组织(FAO)等国际组织都针对TiLV发布了预警公告，要求加强对该病毒的检疫和防范。然而，国内针对TiLV没有有效的预防与治疗技术。因此，如何研究设计一种快速、准确的罗非鱼罗湖病毒(TiLV)检测技术是我们目前迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种能够对罗非鱼罗湖病毒进行准确定性检测的RPA引物、探针及试剂盒。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物，所述RPA引物是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，RPA引物的核苷酸序列为：上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。本专利技术还提供了上述RPA引物在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。本专利技术还提供了一种检测罗非鱼TiLV的探针，所述探针是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，探针的核苷酸序列为：CCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)GCCCACTCTGGGATTGCAGAATC-C3spacer；其中，探针P在第31个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第32个bp位置添加有(BHQ1-dT)基团，在尾部添加有(C3spacer)修饰。本专利技术还提供了上述探针在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。本专利技术还提供了一种检测罗非鱼TiLV的RPA试剂盒，包括上述RPA引物和探针。优选的，还包括冻干酶粉、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、去离子水。优选的，RPA试剂盒包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物ORF10-F、4μL下游引物ORF10-R、2μL探针P、200ng的核酸模板、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。本专利技术还提供了上述RPA试剂盒在制备检测罗非鱼TiLV中的应用。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对罗非鱼罗湖病毒(TiLV)的ORF10基因设计特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对罗非鱼罗湖病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对罗非鱼养殖、进出口检验检疫具有科学指导意义。附图说明图1为感染罗湖病毒(TiLV)罗非鱼和健康罗非鱼的RPA检测结果。具体实施方式为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：基于罗湖病毒的ORF10基因设计RPA引物、探针结构(1)TiLV-ORF10序列为，如序列4所示：GCAAATCTTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGTTGGCCTGTGGATACGAACGAAATCAGAACCGATATTAAGGTGCTAAGACTGCACGTCAAGAGACTTCTTTCCGAAATCTTCGGAAAATCGAGATAGGTCACTCTGCCCATCATCCTCTCTGTCCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCTAGCCCACTCTGGGATTGCAGAATCACAGTCGTCCATCTCGAGGTCGACTTCGTCACCCCACTCTATATTATCTTCACCGCTCTCGTCAGCACCATACCTTTCATTCTTCCAACTTCGCTTCTTTGAAGCAGCTTTCTTGCCCTTCTTGATCTTCCGACTTCTTAGTACTAAACATCCTGAGCTCTCAGCCCCCGAGTCACTGTCACTTGACAAATAATCTGCCACACTCATCCTGGCTTATAGCTATATTTGGTGTTAGTAGGGTTAAAATTTGG。(2)如序列1、2所示，RPA引物的核苷酸序列为：上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。(3)如序列3所示，基于罗湖病毒的ORF10基因设计探针结构，探针的核苷酸序列为：CCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)GCCCACTCTGGGATTGCAGAATC-C3spacer。其中，探针P在第31个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第32个bp位置添加有(BHQ1-dT)基团，在尾部添加有(C3spacer)修饰。实施例2：一种检测罗非鱼TiLV的RPA试剂盒及使用方法(1)试剂盒包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物ORF10-F、4μL下游引物ORF10-R、2μL探针P、200ng的核酸模板、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。(2)使用方法如下：S1、提取待测病毒的总RNA和cDNA合成。S2、RPA扩增反应。反应体系如下：总量为50μL，向含有冻干酶粉(RPA反应的扩增酶，1000IU)的0.2mLTwistAmp反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物，其特征是：所述RPA引物是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，RPA引物的核苷酸序列为：/n上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；/n下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物，其特征是：所述RPA引物是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；
下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。


2.权利要求1所述的RPA引物在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。


3.一种检测罗非鱼TiLV的探针，其特征是：所述探针是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，探针的核苷酸序列为：
CCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)GCCCACTCTGGGATTGCAGAATC-C3spacer；
其中，探针P在第31个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第32个bp位置添加有...

【专利技术属性】
技术研发人员：余乃通，刘志昕，陈中元，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46