检测正呼肠孤病毒的染料荧光定量引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种染料荧光定量RT‑PCR引物、试剂盒及其应用。该引物包括上游引物MRV F和下游引物MRV R，并且所述上游引物MRV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物MRV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的特异性引物及试剂盒可对哺乳动物正呼肠孤病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。

【技术实现步骤摘要】
检测正呼肠孤病毒的染料荧光定量引物及试剂盒
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的染料荧光定量RT-PCR引物及试剂盒。
技术介绍
呼肠孤病毒(Reovirus)是1954年由Sabin,Ramos-Alvarez等从健康儿童的呼吸道与胃肠道中分离得到的，最初认为该病毒与任何疾病都不相关，因此将其命名为呼吸道(Respiratory)、肠道(enteric)、孤儿(orphan)病毒，取3个英文单词的词头，缩写为——呼肠孤病毒(Reovirus)。近年来，哺乳动物正呼肠孤病毒作为呼吸道和消化道疾病的病原受到各国学者的关注。自20世纪50年代起，MRV(哺乳动物正呼肠孤病毒)先后在人类、狗、牛、水貂、果子狸、蝙蝠等哺乳动物上被分离到。MRV被证实不仅能引起人类出血性肠炎、急性呼吸道感染、脑炎等疾病，还能导致其他哺乳动物如狗、水貂等腹泻。目前，能准确、快捷、有效的检测哺乳动物正呼肠孤病毒对于提高对该病毒的防控是至关重要的。根据研究数据表明，该病毒的基因序列变异快，不同毒株之间基因序列差异大，目前国外已有研究者建立了该病毒的检测体系，但其方法在国内并不适用，而国内已有的普通PCR和荧光检测试剂盒又常常出现假阳性问题，因此其检测结果的准确性有待考究。由此可见，我国对于该病毒的检测技术还需要进一步的完善。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的荧光定量RT-PCR引物及试剂盒，该特异性引物及试剂盒可对哺乳动物正呼肠孤病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。本专利技术的技术方案为：第一个方面，本专利技术提供一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的染料荧光定量RT-PCR引物，包括上游引物MRVF和下游引物MRVR，并且所述上游引物MRVF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物MRVR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。第二个方面，本专利技术提供一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的试剂盒，包括上述染料荧光定量RT-PCR引物。进一步的，所述试剂盒还包括：(1)基因扩增试剂、(2)PCR纯化试剂盒、(3)质粒提取试剂盒。采用上述检测哺乳动物正呼肠孤病毒的试剂盒进行哺乳动物正呼肠孤病毒检测的方法，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物对cDNA进行染料荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和CT值，在扩增曲线正常的情况下，若0＜CT值＜35时，则可记为阳性，若CT值＝0时，则可记为阴性。进一步的，所述的反转录步骤包括：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScriptBuffer4μL、2号PrimeScriptRTEnzymeMix1μL、4号Random6mers2μL和5号RNaseFreedH2O9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。进一步的，所述的反转录反应条件为：37℃15min，85℃15s，16℃10min。进一步的，所述的染料荧光定量RT-PCR扩增的反应检测体系为：TBGreenII10μL，上游引物MRVF、下游引物MRVR各0.5μL，cDNA模板1μL，用ddH2O补齐到20μL。进一步的，所述的染料荧光定量RT-PCR扩增的反应条件为:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，56℃反应30sec进行40个循环。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)引物针对的基因靶标较比现有荧光定量PCR的引物针对的基因标靶更为精准：本专利技术设计的引物是基于MRVL1基因，在动物呼肠孤病毒中L1序列相对保守，更加适合用做引物的设计靶点。2)引物设计的可检测范围更为广泛：本专利技术设计的引物是根据国内外公布的所有MRV病毒序列，能够同时对国内外现有的毒株进行检测，而设计范围在高度保守的L1序列。3)本专利技术操作步骤少，只需要常规的提取核酸，进行反转录后就能进行染料荧光定量PCR检测；整个扩增只需要2h即可完成，检测的灵敏度达到7.58×103copies/μL。4)本专利技术的阳性结果鉴定便捷，只需要判断其CT值是否小于“35”即可；比现有检测MRV的核酸电泳或荧光定量PCR的方法更加快捷、准确，为哺乳动物呼肠孤病毒快速诊断和流行病学调查奠定了基础。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术实施例3中引物灵敏度实验的检测结果图，其中A:7.58×109copies/μL；B:7.58×103copies/μL；C:7.58×104copies/μL；D:7.58×105copies/μL；E:7.58×106copies/μL；F:7.58×107copies/μL；G:7.58×108copies/μL。图2是本专利技术实施例3中标准曲线图，在7.58×103～7.58×108copies之间有良好的线性关系，标准曲线斜率为-3.2782，Y轴截距为47.316。图3是本专利技术实施例3中引物特异性实验结果图；其中，1：哺乳动物呼肠孤病毒，2：牛冠状病毒，3：牛轮状病毒样品，4：猪瘟病毒样品，5：猪蓝耳病毒样品，6：大肠杆菌，7：沙门氏菌。具体实施方式本专利技术实施例采用的基因扩增试剂TBGreenII购自TaKaRa公司。本专利技术实施例采用的荧光定量PCR仪购自中国BIOER公司。本专利技术实施例采用的反转录反应试剂为PrimeScriptTMRT试剂，购自宝生物工程(大连)有限公司。本专利技术实施例采用的高速冷冻离心机TGL-16购自中国蜀科公司。本专利技术实施例采用的凝胶成像系统Doc2000购自美国Bio-Red公司。本专利技术实施例采用的倒置生物显微镜购自奥林巴斯公司。本专利技术实施例采用的-20℃医用冰箱、-80℃超低温冰箱购自美菱公司。在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面结合附图和具体的实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。实施例1引物设计根据NCBI登陆的MRV基因的国内外已经发表的毒株序列(AF368033.1，DQ664184.1，DQ997719.1，EF494435.1，GQ468266.1，GU196306.1，HM159613.1，JN799426.1)，应用BeaconDesigner7.7软件设计针对MRV的L1基因的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物MRVF：TATATTGATGCTCTAAATCGTGTG，SEQIDNO:1；下游引物MR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种染料荧光定量RT-PCR引物，其特征在于：该RT-PCR引物包括上游引物MRV F和下游引物MRV R，并且所述上游引物MRV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物MRV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种染料荧光定量RT-PCR引物，其特征在于：该RT-PCR引物包括上游引物MRVF和下游引物MRVR，并且所述上游引物MRVF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物MRVR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种染料荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1所述的染料荧光定量RT-P...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤承，岳华，王远微，陈虹吟，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川;51