用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法技术

一种用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法，本发明专利技术的引物组包括至少一对多重扩增引物，多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，样本标签序列用于识别样本来源，病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。本发明专利技术采用多重扩增技术富集病原核酸目标基因序列，通过将样本标签序列与样本相连，可明确样本来源，同时实现多个样本混合一起进行文库制备，提高检测通量。

【技术实现步骤摘要】
用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法
本专利技术涉及病原检测
，具体涉及一种用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法。
技术介绍
随着高通量测序技术的进步，测序服务对象和应用细分领域不断拓展，高通量测序的市场规模不断增大。高通量测序技术在病原微生物分型检测、病原微生物鉴定及细菌耐药监测方面进入快速发展，应用前景广阔。(一)病原微生物分型检测方面，例如人乳头瘤病毒核酸分型检测。宫颈癌是全球女性的第二位高发癌，其发病主要与高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染有关。每年约有50万新发病例，25万死亡病例，其中发展中国家占2/3。目前已经鉴定出超过200多种HPV型别，其中超过100多种HPV型别会感染皮肤、呼吸道和肛门生殖道粘膜，超过40种HPV型别会感染子宫颈。基于诱导病变的危险程度，可将HPV区分为低危型(例如：HPV6、11、42、43、44型等)和高危型(例HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型等)。因此，HPV感染的及早发现和正确分型对宫颈癌的预防至关重要。然而，HPV的检测方法，仍有待改进。目前国内已经获得国家食品药品监督管理总局批准上市的HPV核酸检测试剂盒共有50多种，涉及检测技术有PCR-荧光探针技术(例如公开号为CN101487063A的专利申请“人乳头瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒”)、PCR-反向斑点杂交技术(例如公开号为CN107090520A的专利申请“一种运用反向点杂交法快速检测HPV基因型的试剂盒”)、基因芯片检测技术(例如公开号为CN103409553A的专利申请“一种用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片、试剂及其试剂盒”)、PCR-表面等离子谐振法以及杂交捕获-化学发光法等。以上检测技术均有准确性高、操作简单、检测周期短等优点，但缺点是检测通量低，检测成本高，不适用于大人群筛查。公开号为WO2013071520A1的专利申请“用于病毒检测的方法和系统”，提供了一种使用双标签进行HPV核酸分型检测的方法，实现了高通检测测序检测，大大降低了检测成本，但由于使用的是接头连接的文库制备方法，操作相对比较繁杂。(二)病原微生物鉴定方面，例如人感染丙型肝炎病毒鉴定检测。丙型肝炎呈全球性流行，全球约1.85亿人感染丙肝病毒(HCV)。慢性HCV感染可进展为肝硬化、肝癌甚至死亡。直接抗病毒药物(DAAs)的出现大大提高了丙型肝炎治疗效果。在中国HCV感染者约2500万人，且近年来新报告的丙型肝炎病例呈稳步增长趋势，已成为相当大的医疗负担，我国2016年HCV感染的总病例数为9,758,760例，其中仅1,775,471例患者被诊断，诊断率仅占18％。因此，HCV感染的及早发现对丙型肝炎的预防和治疗至关重要。目前国内常用的人感染丙型肝炎病毒鉴定检测技术包括两种类型，一种是抗原抗体检测技术，主要方法为酶联免疫吸附测定法(ELISA)，另一种是核酸检测技术(Nucleicacidtechnology，NAT)，主要方法为PCR-荧光法。已经获得国家食品药品监督管理总局批准上市的试剂盒共有30个，其中22个是使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)的试剂盒；其余8个为使用PCR-荧光法的试剂盒，而且均为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型核酸联合检测的试剂盒。无论酶联免疫吸附测定法，还是PCR-荧光法，均有灵敏度高，快速、简便、易于标准化等优点，但均存在检测通量小的缺点。(三)细菌耐药监测方面，例如大肠杆菌耐药基因检测。随着临床上用药抗菌药物日益增多，特别是许多广谱抗生素及新型抗生素在临床上的广泛应用，使细菌耐药性成为全球关注的焦点，其中肠杆菌属细菌是目前临床感染中最重要的病原菌，对抗生素的耐药极其显著。2014年，我国细菌耐药监测报告显示，全国医院上报的1593006株革兰氏阴性菌中，大肠杆菌耐药菌有465136株，占29.2％；2015年，我国细菌耐药监测报告显示，全国医院上报的1705720株革兰氏阴性菌中，大肠杆菌耐药菌有510140株，占29.9％，与2014年同期相比增加10.8％。因此，细菌耐药菌株的监测，对指导临床抗菌药物的合理使用具有重要意义。目前国内大肠杆菌耐药基因最常用的检测方法是药敏培养法，例如江苏三联生物工程有限公司的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌药敏试剂盒(苏食药监械(准)字2014第2400971号)，提供了一种同时检测哌拉西林、头孢曲松、氯霉素、庆大霉素、左氧氟沙星、氨苄西林、阿莫西林四环素等23种抗菌药物的药敏试验试剂盒。药敏培养法操作简单，重复性好，但不适合大规模的检测。FilmArray、Roche、Unyvero等公司均提供了使用PCR-荧光定量法检测细菌耐药基因的技术，PCR-荧光定量法检测自动化程度高、检测周期短、操作简便，但检测覆盖的耐药基因少，检测通量低。其外，Life公司提供了一种覆盖12个细菌18个耐药基因的多重PCR扩增测序检测技术，该技术检测灵敏度高，适用样本类型广泛，但检测成本昂贵。综上，在病原微生物分型检测、病原微生物鉴定及细菌耐药监测的市场不断扩大过程中，现有技术部分检测成本昂贵、部分操作复杂；而且普遍存在检测通量不足等缺点，不适用大人群筛查检测，远远满足不了日益增长的市场检测需求。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法。根据第一方面，一种实施例中提供一种用于病原核酸扩增的引物组，该引物组包括至少一对多重扩增引物，上述多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，上述通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，上述样本标签序列用于识别样本来源，上述病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。在优选实施例中，上述正向引物和反向引物的结构从5’端至3’端依次包括上述通用引物扩增结构序列、上述样本标签序列和上述病原核酸特异性结合序列。在优选实施例中，上述引物组还包括至少一对通用扩增引物，上述通用扩增引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物包括与上述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，上述反向引物包括与上述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列，其中，上述文库标签序列用于识别文库样本来源，上述文库样本是上述多重扩增引物的扩增产物。在优选实施例中，上述通用扩增引物中的反向引物的结构从3’端至5’端依次包括与上述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、上述文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列。在优选实施例中，上述通用引物扩增结构序列选自LP-F或LP-R所示的任一序列：LP-F：GACCGCTTGGCCTCCGACTT；LP-R：ACATGGCTACGATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于病原核酸扩增的引物组，其特征在于，所述引物组包括至少一对多重扩增引物，所述多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，所述通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，所述样本标签序列用于识别样本来源，所述病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于病原核酸扩增的引物组，其特征在于，所述引物组包括至少一对多重扩增引物，所述多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，所述通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，所述样本标签序列用于识别样本来源，所述病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述正向引物和反向引物的结构从5’端至3’端依次包括所述通用引物扩增结构序列、所述样本标签序列和所述病原核酸特异性结合序列。


3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括至少一对通用扩增引物，所述通用扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括与所述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，所述反向引物包括与所述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列，其中，所述文库标签序列用于识别文库样本来源，所述文库样本是所述多重扩增引物的扩增产物。


4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述通用扩增引物中的反向引物的结构从3’端至5’端依次包括与所述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、所述文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列。


5.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述通用引物扩增结构序列选自LP-F或LP-R所示的任一序列：
LP-F：GACCGCTTGGCCTCCGACTT；
LP-R：ACATGGCTACGATCCGACTT。


6.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述通用扩增引物的反向引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹婧，欧日晶，聂自豪，万纯，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44