用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明专利技术提供的犬腺病毒RPA实时荧光检测方法，扩增特异性强，且敏感度高，灵敏度可以达到10

RPA primer pairs, probes, kits and detection methods for detection of canine adenovirus

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测

技术介绍
犬腺病毒可分为犬腺病毒1型(Canineadenovirustype1，CAV-1)和犬腺病毒2型(Canineadenovirustype2，CAV-2)，犬腺病毒1型又称传染性肝炎、狐脑炎病毒、罗巴斯病病毒，是由犬腺病毒1型引起犬等动物的一种急性败血性传染病。主要发生于犬，也可见于其他犬科、鼬科、熊科动物。在犬主要表现肝炎和循环障碍，在狐狸、熊则表现为脑炎。犬腺病毒在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。犬腺病毒自然感染潜伏期6-9天，最急性病例，在呕吐，腹痛和腹泻等症状出现后数小时内死亡。急性型病例，患犬怕冷，体温升高(39.4-41.1℃)，精神抑郁，食欲废绝，渴欲增加，呕吐，腹泻，粪中带血。亚急性病例症状轻微咽炎和喉炎可致扁桃体肿大；颈淋巴结发炎可致头颈部水肿。特征性症状是角膜水肿，即“蓝眼”病。眼疼痛反射通常在角膜完全浑浊后逐渐减弱，但若发展为青光眼或角膜穿孔则病情加剧。慢性病例多发于老疫区或疫病流行后期，多不死亡，可以治愈。犬腺病毒对犬尤其是1年内的幼犬有严重危害，能引起犬的肝、胆、肾、淋巴器官的病变。还能引起犬的血象变化，如白细胞和血小板减少等，可对相关实验数据造成误差。此外，大剂量接种可使豚鼠感染，以豚鼠作为实验动物也存在潜在影响。犬腺病毒2型(Canineadenovirustype2，CAV-2)可引起犬的传染性喉气管炎，临床表现为持续高热、咳嗽、浆液-黏液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎，还能引起腹泻。犬腺病毒2型代表株多伦多A26/61的基因组大小为31323bp，与犬腺病毒1型的同源性为89％，基因组分区和犬腺病毒1型相似，犬腺病毒1型和2型的E3区两侧的基因高度同源，表现在犬腺病毒2型的E3区比犬腺病毒1型长500bp。犬腺病毒对幼犬的危害非常大，感染率近几年有上升的趋势，因此建立一种及时、准确的检测技术，对该病的防控具有十分重要的意义。目前，诊断犬腺病毒的实验方法有病毒分离法、PCR法，包括普通PCR方法和荧光定量PCR方法、间接免疫荧光法、琼脂扩散试验法(AGP)、HA/HI、补体结合实验、中和试验和ELISA方法，还有最近发展的环介导等温扩增方法(LAMP)。其中，PCR方法因其简便快捷而被广泛使用的检测方法，传统诊断犬腺病毒的方法依赖于PCR检测方法。但操作时间过长且对操作要求高。LAMP方法是一种等温扩增利用2对引物的方法，但引物设计麻烦且假阳性率高。重组酶聚合酶扩增(RecombinasepolymeraseamplificationRPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法和荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。与传统的CAV诊断方法相比，反应时间快。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内。目前国内外尚无采用实时荧光RPA检测CAV的报道，因此建立快速准确的检测犬腺病毒CAV的RPA方法非常有必要。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法。本专利技术针对犬腺病毒的E3序列，设计特异引物对、探针，建立了实时荧光RPA检测方法，为犬腺病毒的快速诊断及防控提供了技术参考。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示：F:5′-TAATTTCATTACCTTCAACATAACTGTACC-3′(SEQIDNo.1)；R:5′-TTTAAACAGAGTCCATTCCATAAAACTGTC-3′(SEQIDNo.2)。本专利技术还提供一种用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其序列如SEQIDNo.3所示：5′-CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATTTFNATQCAACACGAGCCCCCAAAAATG-3′(SEQIDNo.3)。其中TF表示连接有荧光基团的T，TQ表示连接有淬灭基团的T，TF和TQ之间的碱基N用四氢呋喃残基THF替换，3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任一种。优选地，修饰后的探针序列为：CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATT[FAM-dT][THF]A[BHQ1-dT]CAACACGAGCCCCCAAAAATG(C3spacer)。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高RPA检测的特异性，另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。本专利技术还提供一种用于检测犬腺病毒的RPA试剂盒，包含上述的RPA引物对和RPA荧光探针。所述的RPA试剂盒，还包括其他重组酶聚合酶扩增(RPA)所需试剂：酶、dNTP、Buffer、MgOA等；所述的RPA试剂盒，还包括其阴性对照和阳性对照；所述阴性对照品为水空白对照；所述阳性对照品为犬腺病毒，浓度是1μg/mL。所述的RPA试剂盒中的试剂还可以采用市售商品试剂。本专利技术还提供一种用于检测犬腺病毒的实时荧光RPA方法，步骤如下：(1)提取待测样本DNA作为模板；(2)用本专利技术的引物对及荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；(3)根据荧光信号即可快速实现病毒检测。优选地，所述步骤(2)用本专利技术所述的RPA引物对及RPA荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；具体地，采用50uL反应体系进行RPA反应：反应体系包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子。RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20-30分钟。所述样本取自血液、咽拭子、肺部组织、肠内容物、粪便、直肠拭子等。本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术首次采用实时荧光RPA检测CAV。本专利技术提供的犬腺病毒RPA实时荧光检测方法，扩增特异性强，且敏感度高。本专利技术检测方法的灵敏度可以达到102拷贝。2、本专利技术的引物对和探针是针对犬腺病毒E3基因序列设计筛选获得的，因此扩增更高效，特异性更高。3、本专利技术RPA实时荧光检测方法简单，对温度和机器要求低，用时短，适合实验室或现场快速检测。本专利技术为犬腺病毒快速检测诊断及防控提供了技术参本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对，其特征是，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对，其特征是，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。


2.一种用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其序列如SEQIDNo.3所示：
5′-CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATTTFNATQCAACACGAGCCCCCAAAAATG-3′；其中TF表示连接有荧光基团的T，TQ表示连接有淬灭基团的T，TF和TQ之间的碱基N用四氢呋喃残基THF替换，3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。


3.如权利要求2所述的用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其特征是，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任一种。


4.如权利要求3所述的用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其特征是，所述探针序列为：CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATT[FAM-dT][THF]A[BHQ1-dT]CAACACGAGCCCCCAAAAATG-C3spacer。


5.一种用于检测犬腺病毒的RPA试剂盒，其特征是，包...

【专利技术属性】
技术研发人员：练月晓，丛锋，黄韧，朱才毅，
申请(专利权)人：广东省实验动物监测所，广州千寻生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44