一种检测巨细胞病毒耐药性的引物组、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测巨细胞病毒耐药性的引物组、检测方法及试剂盒。该引物组能够高度特异性的扩增出巨细胞病毒UL97基因的目的片段，可以用于分析其耐药基因位点突变，为临床提供理论指导。本发明专利技术提供的检测方法操作简单、准确、特异性高。

A primer set, detection method and kit for detecting drug resistance of cytomegalovirus

【技术实现步骤摘要】
一种检测巨细胞病毒耐药性的引物组、检测方法及试剂盒
本专利技术涉及病毒基因突变检测
，具体而言，涉及一种检测巨细胞病毒耐药性的引物组、检测方法及试剂盒。
技术介绍
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒家族中基因组最大的成员，可编码200多种蛋白质。HCMV主要感染人类，尚无动物感染模型。HCMV裂解复制增殖较缓慢，周期较长，除形成核内包涵体，HCMV具有能引发核周和细胞质包涵体产生和形成巨细胞的特性，并因而得名。HCMV在人群中感染非常普遍，我国高达60％～80％的人群HCMV抗体为阳性。10％～15％儿童在5岁之前初次感染HCMV，5岁后感染的比例大幅下降。在成年人中感染比率逐年増加1％～2％，可能与带毒人群密切接触和性接触有关。从患者的唾液、宫颈分泌物、精液、尿液和白细胞等标本均可分离获得HCMV。35％的先天性和围产期感染HCMV的婴儿可在长达5年的时间里排除病毒。人体感染HCMV后可导致内脏疾病，约1％的婴儿为先天性感染HCMV。大部分HCMV感染者是无症状的，但约20％患者可出现神经功能缺损。不管是儿童还是成年人都可能会被这种病毒所感染。临床比较常见的症状表现为发烧，也可以表现不同程度的肝功能损害以及肝脏、淋巴结的肿大等。此外，HCMV原发或重新激活也是免疫功能低下患者发病和死亡的重要原因。进行了实体器官移植或造血干细胞移植的患者，因接受免疫抑制剂的原因自身免疫力低下很容易感染巨细胞病毒而造成较严重的并发症。现有研究表明HCMV的耐药相关基因主要集中在UL97或UL54上，其中UL97基因突变相对更多。GCV通过靶向病毒聚合酶pUL54来阻止HCMV复制。而作为激活的第一步，GCV必须被病毒磷酸转移酶pUL97单磷酸化。UL97和/或UL54的突变可以自发产生，并在抗病毒压力下被选择，可导致治疗失败并经常导致死亡。94％的耐药相关突变发生在UL97中并损害GCV的磷酸化。治疗HCMV的药物主要有丙氧鸟苷(GCV)，膦甲酸钠和西多福韦等。丙氧鸟苷又名苷昔洛韦/更昔洛韦，其主要适应症为严重免疫功能低下患者发生的巨细胞病毒性视网膜炎、艾滋病、器管移植、恶性肿瘤等，以及肺炎、胃肠炎、肝脏和中枢神经系统CMV感染。体内外试验证明:它是一种高效低毒、具有较强选择性的广谱抗疟疾病毒化疗剂。是国内用于治疗各种类型的HCMV感染的最广的抗病毒药物，其疗效比无环鸟苷强50～100倍，总有效率可达70～80％。目前检测HCMV耐药方法主要有两种：表型检测和基因检测。表型方法系通过细胞培养，让一定量的病毒在配有不同浓度的抗病毒药物的培养基中生长，最后计算药物的半抑制浓度(IC50)，依据实验结果把病毒分为敏感型和耐药型，由于HCMV病毒培养时间一般需要1～14天，因此该方法存在检测耗时、费力、不适于大规模批量检测；基因型检测方法是通过对HCMV临床分离株的相关耐药基因进行扩增并测序，通过与敏感基因的序列进行比对后判断此毒株是否为耐药株，而现有的基因型检测方法由于UL97基因耐药突变位点众多，根本无法全部涵盖这些位点，且存在检测特异性差，灵敏度低的缺陷。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测巨细胞病毒耐药性的引物组、检测方法及试剂盒以解决上述问题。本专利技术是这样实现的：一种用于检测巨细胞病毒耐药性的引物组，检测巨细胞病毒耐药性包括检测UL97基因突变，用于检测巨细胞病毒耐药性的引物组包括如下引物组合中的至少一种：第一引物组：其包括第一引物对和第二引物对；第二引物组：其包括第三引物对和第四引物对；其中，第一引物对包括SEQIDNO.1-2所示的引物；第二引物对包括SEQIDNO.3-4所示的引物；第三引物对包括SEQIDNO.5-6所示的引物；第四引物对包括SEQIDNO.7-8所示的引物。本专利技术提供了一种巢式PCR引物，该巢式PCR引物在PCR反应过程中具有扩增效率高，特异性好的优势。使用任意引物组进行巢式PCR均可以实现待测样品的UL97基因耐药突变检测。其中，第一对引物对的正向引物序列(即上游引物)UL97-F1和第一对引物对的反向引物序列(即下游引物)UL97-R1将从1247-2175位区域扩增出929bp的序列。根据NCBI数据库，我们得到了UL97基因的全长序列共2124bp，起始密码子为ATG(为了方便起见，设置起始密码子的碱基A为碱基位置起始点1)，终止密码子为TAA。为了扩增出尽可能长的UL97基因序列，UL97-R1引物对应的位置实际上是位于UL97基因终止密码子之后的位置。终止密码子之后的序列是为了方便比对而引入。参照SEQIDNO.10所示，从第2125bp往后即为本专利技术为了方便比对而引入的序列。起始密码子和终止密码子之间的序列为完整的UL97序列，其GeneID为3077517，位于NC_006273.2序列的141798-143921之间。根据文献报道，大多数耐药突变聚集在460，594和595残基中。即1380-1785bp之间。本申请提供的巢式PCR反应，扩增范围包括了此耐药突变高发区。基本不存在因未能扩增出UL97基因全长，而漏检了某突变的情况。第二对引物对的正向引物序列(即上游引物)UL97-F2和第二对引物对的反向引物序列(即下游引物)UL97-R2将从SEQIDNO.9序列的1347-2016位区域扩增出670bp的片段。其扩增模板为第一引物对第一轮PCR反应的产物。第三对引物对的正向引物序列(即上游引物)UL97-F3和第三对引物对的反向引物序列(即下游引物)UL97-R3将从SEQIDNO.9序列的1232-1982位区域扩增出751bp的片段。第四对引物对的正向引物序列(即上游引物)UL97-F4和第四对引物对的反向引物序列(即下游引物)UL97-R4将从SEQIDNO.9序列的1256-1904位区域扩增出649bp的片段。一种检测巨细胞病毒耐药性的方法，使用引物组中的第一引物组或第二引物组对待测核酸样品进行巢式PCR。使用第一引物组对待测核酸样品进行巢式PCR包括：以第一对引物对待测核酸样品进行第一轮PCR扩增，得到第一对引物的第一轮PCR扩增产物；以第一对引物的第一轮PCR扩增产物为模板，用第二对引物进行第二轮PCR扩增；并将第二轮PCR扩增产物进行检测。以第一对引物对待测核酸样品进行第一轮PCR扩增的反应程序为：(1)94-95℃，预变性3-5min；(2)94-95℃，变性30-35s，58-58.5℃退火35-38s，70-72℃延伸1-1.1min，共35-36个循环；(3)70-72℃延伸5-6min；以第二对引物对第一对引物的第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增的反应程序为：(1)94-95℃，预变性3-5min；(2)94-95℃，变性30-35s，59-59.5℃退火35-38s，70-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测巨细胞病毒耐药性的引物组，其特征在于，检测巨细胞病毒耐药性包括检测UL97基因突变，用于检测巨细胞病毒耐药性的引物组包括如下引物组合中的至少一种：/n第一引物组：其包括第一引物对和第二引物对；/n第二引物组：其包括第三引物对和第四引物对；/n其中，第一引物对包括SEQ ID NO.1-2所示的引物；/n第二引物对包括SEQ ID NO.3-4所示的引物；/n第三引物对包括SEQ ID NO.5-6所示的引物；/n第四引物对包括SEQ ID NO.7-8所示的引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测巨细胞病毒耐药性的引物组，其特征在于，检测巨细胞病毒耐药性包括检测UL97基因突变，用于检测巨细胞病毒耐药性的引物组包括如下引物组合中的至少一种：
第一引物组：其包括第一引物对和第二引物对；
第二引物组：其包括第三引物对和第四引物对；
其中，第一引物对包括SEQIDNO.1-2所示的引物；
第二引物对包括SEQIDNO.3-4所示的引物；
第三引物对包括SEQIDNO.5-6所示的引物；
第四引物对包括SEQIDNO.7-8所示的引物。


2.一种检测巨细胞病毒耐药性的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组中的所述第一引物组或所述第二引物组对待测核酸样品进行巢式PCR。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用所述第一引物组对所述待测核酸样品进行巢式PCR包括：
以第一对引物对所述待测核酸样品进行第一轮PCR扩增，得到第一对引物的第一轮PCR扩增产物；以第一对引物的第一轮PCR扩增产物为模板，用第二对引物进行第二轮PCR扩增；并将第二轮PCR扩增产物进行检测。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以第一对引物对所述待测核酸样品进行第一轮PCR扩增的反应程序为：(1)94-95℃，预变性3-5min；(2)94-95℃，变性30-35s，58-58.5℃退火35-38s，70-72℃延伸1-1.1min，共35-36个循环；(3)70-72℃延伸5-6min；
以第二对引物对第一对引物的第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增的反应程序为：(1)94-95℃，预变性3-5min；(2)94-95℃，变性30-35s，59-59.5℃退火35-38s，70-72℃延伸40-45s，共35-36个循环；(3)70-72℃延伸5-6min。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓频，
申请(专利权)人：倍科为天津生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12