【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸测序领域。具体地，本专利技术涉及使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸测序。
技术介绍
1、第二代测序技术基于第一代sanger测序技术发展而来，具有低成本，高通量，自动化等特征，极大地推进了基因测序产业的发展。二代测序技术目前已经广泛应用于全基因组测序，转录组测序，宏基因组测序等，是分析生物的进化与分类，研究癌症，自闭症等疾病相关基因，以及进行体外诊断等的有力工具，促进了人们对于生命科学的进一步了解，也推动了健康产业的发展。
2、现有的第二代测序技术主要包括illumina的sbs测序技术(sequencing-by-synthesis，合成法测序)，life technologies公司的半导体测序技术，和bgi的联合探针锚定聚合技术(cpas)。sbs测序技术使用同时具有两个修饰部分(荧光标记和阻断基团)的dntp(datp,dctp,dgtp,dttp)，其中datp、dctp、dgtp、dttp分别携带不同的荧光标记。由于阻断基团的存在，在发生聚合反应时，在每个核酸模板上只会加上一个互补的dntp，检测该dntp所携带的荧光标记即可确定该添加的互补dntp的身份，随后用试剂对可逆阻断基团和荧光标记进行切除(被称为再生反应)，进行下一步聚合反应(p085，基因组学，2016年第一版，杨焕明著)。半导体测序技术利用在模板链延伸时聚合上去的dntp释放的焦磷酸导致的ph值变化，通过芯片底部的传感器检测这一
3、现有二代测序技术的生化反应部分主要采用流道式系统来进行。典型的流道式系统可参见wo2007123744，其使用包括流通池的固体衬底，流通池包括多核苷酸附接于其中的一个或多个流体通道，并通过导流系统将荧光标记试剂可控地流动通过流体通道从而与多核苷酸接触。以illumina的hiseq 2500平台为例，该平台使用流动槽，将测序反应试剂在特定时间点的特定位置从制冷设备泵入流动槽，在一套复杂的流体控制设备的控制下流经测序芯片，并且辅助以精细的温控设施，确保在尽可能短的时间内让生化反应得以充分进行(2500system guide，illumina，2015)。
4、现有二代测序方法需要精确的温度控制和流体控制，成本较高，且容易出现反应不均匀现象。试剂都是一次性使用，利用率较低，进一步提高了测序成本。采用流道式方案的现有二代测序平台如hiseq 2500等还存在通量较低的情况，每一台的通量小于1wgs/天，参考https://www.illumina.com.cn/systems/hiseq_2500_1500/performance_specifications.html。
5、因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的二代测序方法。
技术实现思路
1、针对现有二代测序方法存在的问题，本专利技术提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸测序。如本文所用的术语“浸泡式反应方案”是相对于现有技术使用的流道式系统而提及的，其意指在对核酸进行测序的过程中，使待测序的核酸移动至与反应试剂接触，而非使用流动通道使反应试剂移动至与核酸接触。所述浸泡式反应方案至少具有以下优势：1.生化试剂重复利用；2.扩展性好，使用灵活，能够大幅提高通量；3.不需要复杂的温度和流体控制系统，反应较均匀；4.显著降低基因测序成本。
2、在本文所述的方法中，核酸测序可以利用多种测序方法实现。测序方法的实例包括但不限于电泳、合成法测序、连接法测序、联合探针锚定聚合测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法。在一些实施方案中，确定靶核酸的核苷酸序列的过程可以是自动化过程。
3、应当理解，任何测序过程都可以结合到本文所述的方法中。此外，应当理解，可以容易地实施其它已知的测序过程，用于本文所述的方法。
4、因此，在一个实施方案中，本专利技术提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括以下步骤：
5、a.提供其上固定有核酸分子的第一批次的固体支持物，
6、b.将所述第一批次的固体支持物浸泡在一种或多种反应溶液中，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，所述一种或多种反应溶液各自置于分开的反应容器中，
7、其中在将所述第一批次的固体支持物从每一种反应溶液中移出后，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的反应溶液，
8、c.检测所述第一批次的固体支持物上的所述信号，
9、d.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于另外的反应容器中的再生溶液中，以消除固体支持物上的所述信号，
10、e.从再生溶液中移出所述第一批次的固体支持物，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的再生溶液，
11、f.任选地，重复步骤b至e或b至c。
12、在一个实施方案中，步骤b至e可重复一次或多次，例如重复1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多次。
13、在某些实施方案中，洗涤通过将固体支持物浸泡在包含洗涤溶液的反应容器中进行。
14、如本文所用，所述浸泡包括使得固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂或溶液接触的任何方式。固体支持物可以例如以垂直、倾斜或水平的方式部分或全部浸泡在反应容器中，条件是固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂接触。
15、如本文所用的被测序的“核酸分子”可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或由核苷酸类似物制成的dna或rna的类似物，其可以与“多核苷酸”互换使用。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。核酸分子可以来源于双链dna(dsdna)形式(例如，基因组dna、pcr和扩增产物等)，或者可以来源于如dna(ssdna)或rna的单本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌套批次的对核酸分子进行测序方法,所述测序方法包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括更多个批次的固体支持物按照所述嵌套方法对每个批次的固体支持物重复步骤b至c或b至e，
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物为非流动通道式的固体支持物。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述固体支持物选自珠子、芯片、玻璃表面、传感器、电极或硅晶片。
5.根据权利要求1所述的方法,其中步骤b的一种或多种反应溶液包含含有聚合酶、测序引物、经标记的核苷酸或其混合物的溶液,使固相支持物与聚合酶、测序引物和经标记的核苷酸中的每一种接触,其中固相支持物上的信号由互补结合至固相支持物上的核酸分子的经标记的核苷酸产生。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述经标记的核苷酸是经荧光标记的核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d的再生溶液包含能够从经标记的核苷酸上去除标记的试剂,优选地,经标记的核苷酸还包含3'阻断基团。
8.权利要求1所述的方法，其中将第N批次的固体支持物与步骤b
9.权利要求1所述的方法，其中在步骤f的任选重复步骤b至e的过程中，在每次重复时更换或不更换步骤b的所述一种或多种反应溶液和/或步骤d的所述再生溶液。
10.权利要求9所述的方法，其中当步骤b的所述一种或多种反应溶液的反应温度在55℃以下时，更换步骤b的所述一种或多种反应溶液的时间间隔为小于8小时，或其中当步骤b的所述一种或多种反应溶液的反应温度在45℃以下时，更换步骤b的所述一种或多种反应溶液的时间间隔为小于24小时。
...【技术特征摘要】
1.一种嵌套批次的对核酸分子进行测序方法,所述测序方法包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括更多个批次的固体支持物按照所述嵌套方法对每个批次的固体支持物重复步骤b至c或b至e，
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物为非流动通道式的固体支持物。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述固体支持物选自珠子、芯片、玻璃表面、传感器、电极或硅晶片。
5.根据权利要求1所述的方法,其中步骤b的一种或多种反应溶液包含含有聚合酶、测序引物、经标记的核苷酸或其混合物的溶液,使固相支持物与聚合酶、测序引物和经标记的核苷酸中的每一种接触,其中固相支持物上的信号由互补结合至固相支持物上的核酸分子的经标记的核苷酸产生。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述经标记的核苷酸是经荧光标记的核苷酸。
...【专利技术属性】
技术研发人员：杨晋，徐讯，王卉，谢槟，李卓坤，赵胜明，陈奥，徐崇钧，章文蔚，倪鸣，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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