用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品制造技术

本发明专利技术提供了一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品，所述内参基因为DDX5基因。本发明专利技术还设计了针对内参基因的引物和探针。与美国CDC用的内参基因RNase P(RPP30)及对应引物和探针相比，本发明专利技术所设计和筛选的针对本发明专利技术内参基因的引物和探针高度特异，仅对mRNA扩增，而不对基因组DNA扩增；并且本发明专利技术内参基因在人群中可被稳定检出。

【技术实现步骤摘要】
用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品
本专利技术涉及呼吸道RNA病毒检测
，具体涉及一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品。
技术介绍
呼吸道病毒(respiratoryvirus)感染是导致全球死亡、残疾的最主要原因之一。据统计，上世纪流感病毒致死人数超过1亿人[EricTBeck,2010]；在5岁以下儿童中，急性下呼吸道感染导致的死因占20％以上，其中尤以肺炎最为严重，占比超过90％[JeanneCarr,2010]。此外，本世纪新型呼吸道病毒频现，如重症急性呼吸综合征病毒(SARS病毒，2002年)、中东呼吸综合症病毒(MERS病毒，2012年)、新型冠状病毒(SARS-COV2病毒，2019年)，严重危害人类生命、导致惨重的社会经济损失。早期精确诊断呼吸道病毒有利于迅速确定诊疗方案、采取隔离措施控制疫情。目前相关诊断技术较多，包括病毒分离、病毒抗原检测、病毒核酸检测和抗体检测等[Walter,J.M.2018]。呼吸道病毒以RNA病毒为主(见下表1)，其PCR检测方法主要有反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、反转录-普通PCR、反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)、反转录-依赖核酸序列的扩增(RT-NASBA)、反转录-滚环扩增(RT-RCA)、反转录-单引物等温扩增(RT-SPIA)、反转录-依赖解旋酶DNA等温扩增(RT-HDA)、反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)、反转录-链替代扩增(RT-SDA)等基因扩增技术。这些技术都是通过设计相关引物序列，对待检测基因序列的数量进行扩增放大，以促使待测基因被检出。其中，RT-qPCR可特异检测病毒RNA，具备快速、灵敏、特异性高等优势，是当前最常用的诊断技术。表1呼吸道病毒及对应病毒核酸[Somerville,L.K.2015]表附注：ss为单链，ds为双链，(+)为正链(单链病毒RNA可直接行使mRNA功能)，(–)为负链(单链病毒RNA需先合成互补链，由互补链行使mRNA功能)尽管具备多项优势，但假阴性仍是目前PCR检测尤其是RT-qPCR存在的主要问题之一。对新发现的病毒，RT-qPCR结果假阴性的原因可能来自多个方面：1)新发现病毒的病理特性尚不完全清楚，尚无法准确判定合适的病理样本采集位置和采集时间；2)新开发的诊断试剂盒检测灵敏度参差不齐；3)RNA稳定性远低于DNA，而相关诊断实验涉及流程多，包括临床样本采集、样本保存运输、RNA提取、RT-qPCR反应，其中任何一步操作失误导致RNA被降解或者扩增反应失败，都可导致实验假阴性。内参基因在所有人群中表达水平相近，研究显示，RT-qPCR诊断病原的同时检测样本中内源基因的mRNA，可有效对临床样本采集、样本保存运输、RNA提取、RT-qPCR反应等全实验过程进行质控，排除实验操作失误、试剂故障、反应失败，一定程度上可规避假阴性，提升诊断结果的可靠度。事实上，早在SARS期间，美国CDC就已将内参基因RNaseP的P30基因(RPP30)应用于病原RT-qPCR诊断[ShannonL.Emery，2004]，以提升诊断结果的可靠度，该基因及相关引物探针序列一直沿用至今(序列见表2)。在国内，目前普遍采用的质控方式是，在样品运输到实验室后，在核酸提取之前或在RT-qPCR之前加入外源基因或含外源基因的假病毒，该方法并不能有效监控到上游样本采集和运输保藏过程，且增加额外的实验操作步骤和物料成本。表2内参基因RnaseP的引物和探针进一步分析针对内参基因RPP30的扩增序列，发现其在人基因组DNA中存在100％相同的序列(图1)，即对应引物和探针既可扩增RNA，可以扩增基因组DNA。这提示，即使实验过程中RNA丢失(RNA被降解、RNA未被有效提取出、反转录反应失败)，也极可能通过对相应基因组DNA作扩增，获得内参基因的“有效”检出，导致阴性判定，但实际可能为假阴性。事实上，美国CDC也曾做出提醒，称其针对RPP30的引物和探针可同时对RNA和DNA进行扩增，并不适合用作反转录过程的质控品[USCDC,RT-PCRforMumpsVirusRNA,2010]。
技术实现思路
本专利技术基于现有技术的不足，提供了一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因及其检测产品。本专利筛选一个新的内参基因DDX5及相关引物和探针序列，用于监控呼吸道RNA病毒RT-qPCR的实验过程。该基因过去常被用作肿瘤基因表达定量的归一化，而在本专利技术中该基因被筛选出，并首次被应用于呼吸道RNA病毒PCR诊断质控。所设计的针对该基因的引物和探针序列高度特异，仅识别待检测基因的mRNA，不与人基因组DNA交叉反应。使用该内参基因可更真实指示咽拭子样本中病毒RNA的完整性和实验流程的正确性，提高呼吸道RNA病毒PCR诊断准确度。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供了一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因，所述内参基因为DDX5基因。优选地，所述呼吸道RNA病毒包括重症急性呼吸综合征病毒、中东呼吸综合症病毒、新型冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人鼻病毒(HRV)、人肠道病毒(HEV)中的任一种。鼻咽拭子是呼吸道RNA病毒PCR诊断最普遍和通用的临床样本之一，本专利技术筛选获得适用于咽拭子样本的内参基因TBP和引物和探针组合，因此该基因及引物探针组合可应用到含上述的任一种病毒的呼吸道RNA病毒PCR诊断方法中，以提高诊断准确度。优选地，所述PCR检测包括反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测、反转录-普通PCR检测、反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测、反转录-依赖核酸序列的扩增(RT-NASBA)检测、反转录-滚环扩增(RT-RCA)检测、反转录-单引物等温扩增(RT-SPIA)检测、反转录-依赖解旋酶DNA等温扩增(RT-HDA)、反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)、反转录-链替代扩增(RT-SDA)等基因扩增技术中的任一种。这些技术都是通过设计相应的引物，对待检测基因序列的数量进行扩增放大，以促使待测基因被检出。因此本专利技术筛选得到的内参基因DDX5基因可应用到上述的任一种PCR检测方法中，以提高诊断准确度。第二方面，本专利技术提供了一种用于检测前述的内参基因的引物，所述DDX5基因的引物序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示。第三方面，本专利技术提供了一种用于检测权前述的内参基因的探针，所述DDX5基因的探针序列如SEQIDNO.15所示。第四方面，本专利技术提供了一种新型冠状病毒RT-PCR检测产品，包括用于检测权利要求1所述内参基因DDX5基因的引物和探针；所述引物序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示，探针序列如SEQIDNO.15所示。优选地，所述检测产品包括检测试剂盒、检测试纸。第五方面，本专利技术提供了一种用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因，其特征在于，所述内参基因为DDX5基因。/n

【技术特征摘要】
20200319 CN 20201019833881.一种用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因，其特征在于，所述内参基因为DDX5基因。


2.根据权利要求1所述的用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因，其特征在于，所述呼吸道RNA病毒包括重症急性呼吸综合征病毒、中东呼吸综合症病毒、新型冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人类偏肺病毒、人鼻病毒、人肠道病毒中的任一种。


3.根据权利要求1所述的用于呼吸道RNA病毒PCR检测的内参基因，其特征在于，所述PCR检测包括反转录-实时荧光定量PCR检测、反转录-普通PCR检测、反转录-环介导等温扩增检测、反转录-依赖核酸序列的扩增检测、反转录-滚环扩增检测、反转录-单引物等温扩增检测、反转录-依赖解旋酶DNA等温扩增、反转录-重组酶聚合酶扩增、反转录-链替代扩增等基因扩增技术中的任一种。


4.一种用于检测权利要求1所述的内参基因的引物，其特征在于，所述DDX5基因的引物序列如SEQIDNO.13和...

【专利技术属性】
技术研发人员：仲从浩，王科，张震，聂东升，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31