一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及快速检测方法技术

本发明专利技术公开一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及快速检测方法，包括步骤：对采集样本进行灭活，并提取病毒RNA；将经所述步骤S1提取质检合格的病毒RNA反转进行cDNA合成；使用特异引物进行片段扩增形成PCR反应产物样品；对所述PCR反应产物样品进行标识，并构建测序文库；所述测序文库进行纳米孔测序操作；本发明专利技术测序质量良好，通过本发明专利技术得到的样本比对到新冠基因组时，可实现最高达94.16％的reads比对率，从而可以辅助判定患者的感染情况，可实现新型冠状病毒的快速精准检测。

A novel coronavirus specific primer and rapid detection method for detection of new coronavirus

【技术实现步骤摘要】
一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及快速检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及快速检测方法。
技术介绍
新型冠状病毒(2019-nCoV)感染目前传播性强、致死率较高，是国家关注的主要公共卫生问题。同时，目前也是其他呼吸道病毒流行的季节，为临床诊断和鉴别诊断带来巨大的影响。鉴于冠状病毒的高度流行性、分布性和广泛性，基因的多样性和基因组的频繁重组，以及不断增加的人类与动物的交互行为，新型冠状病毒很有可能会在人类中周期性地出现，因此迫切需要研究对其快速检测的方法。现有技术中最快速有效的核酸检测方法为RT-PCR，使用的具体技术为新型冠状病毒RT-PCR试剂盒，但是这种方法存在一定的缺陷，根据试剂盒说明书提供的RT-PCR体系中加入一对至三对不等的特异性的引物进行特异性的检查，检测区域为ORFlab，N区和E区。由于没有完全覆盖2019-nCoV的全基因组区域，其准确性受到一定影响，且RNA病毒存在易变异和重组的特点，目前已有多例阳性患者RT-PCR检测是阴性的案例发生。对于鉴别诊断或被检样品数量大，检测项目多的时候就需要耗费大量试剂、耗材与时间，另外因此造成的漏筛给后续的确诊和防控也带来相应的困难。鉴于上述缺陷，本专利技术创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本专利技术。
技术实现思路
为解决上述技术缺陷，本专利技术采用的技术方案在于，提供一种用于新型冠状病毒检测的特异引物，包括49组引物对，所述引物对如下列表所述：<br>较佳的，一种快速检测方法，包括步骤：s1，对采集样本进行灭活，并提取病毒RNA；S2，将经所述步骤S1提取质检合格的病毒RNA反转进行cDNA合成；S3，使用所述特异引物进行片段扩增形成PCR反应产物样品；S4，对所述PCR反应产物样品进行标识，并构建测序文库；S5，所述测序文库进行纳米孔测序操作。较佳的，在所述步骤S1中，提取的病毒RNA浓度满足吸光度为A260/A280状态下比值在1.9到2.0之间为合格。较佳的，在所述步骤S2中利用随机引物以提取的病毒RNA为模板进行cDNA合成。较佳的，将49组所述特异引物对根据引物对序号按照奇偶序号分成两组混在一起，生成所述第一基因特异性引物池和所述第二基因特异性引物池，通过混合5μL的100μM的奇序号引物对最终形成100μM的125μL的所述第一基因特异性引物池，然后通过超纯水稀释形成10μM的第一工作液，通过混合5μL的100μM的偶序号引物对最终形成100μM的120μL的所述第二基因特异性引物池，然后通过超纯水稀释形成10μM的第二工作液。较佳的，将所述步骤S2的cDNA进行多重PCR扩增，反应体系为：12.5μL的2x高准确率超保真DNA聚合酶反应液、3.6μL的所述第一工作液或所述第二工作液、6.4μL的无核酸酶水和2.5μL的cDNA，共计25μL的所述反应体系；多重PCR反应条件为：98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火及延伸1分钟，共循环25次(初始RNA样本ct值为18～21)或35次(初始RNA样本ct值为35)，最后在65℃延伸5分钟，最终形成PCR反应产物，结束反应；PCR反应产物纯化和质检：在所述反应体系中，添加的所述第一工作液所生成的PCR反应产物为第一PCR反应产物，添加的所述第二工作液所生成的PCR反应产物为第二PCR反应产物，混合所述第一PCR反应产物和所述第二PCR反应产物形成混合PCR反应产物，通过磁珠对所述混合PCR反应产物进行纯化生成纯化PCR反应产物。较佳的，利用Qubit检测对所述纯化PCR反应产物进行质检，所述纯化PCR反应产物浓度大于25ng/μL时，采用10nM的Tris稀释，并重新进行质检；将通过质检后的所述纯化PCR反应产物稀释到1ng/μL形成PCR反应产物样品。较佳的，在所述步骤S4中，配置标识基体体系，其中15μL的所述标识基体体系中包括5μL的所述PCR反应产物样品、7.5μL的无核酸酶水、1.75μL的UltraII末端修复反应缓冲液、0.75μL的UltraII末端修复酶；配置标识反应体系，其中35.5μL的所述标识反应体系中包括2.5μL的无扩增条形码barcode，17.5μL的UltraII连接酶反应缓冲液、0.5μL的连接增强剂；将所述标识基体体系在室温反应10分钟，65℃反应5分钟，冰上放置1分钟后加入所述标识反应体系，继续在室温反应15min，70℃反应10min，冰上放置1min，最终获得barcoded片段。较佳的，将所有所述barcoded片段混在一起：首先采用1∶1的AMPureXP磁珠纯化，30μL洗脱，后等比将所述barcoded片段混在一起，用Qubit定量，形成初始文库。较佳的，配置接头体系，其中，100μL的所述接头体系中包括65μL的所述初始文库，20μL的NEBNextQuickLigationReactionBuffer(5X)、5μL的AMIIadaptermix、10μL的QuickT4DNALigase；将所述接头体系在室温状态下放置15min后，加入100μL磁珠进行纯化，15μL洗脱，并最终形成测序文库，对所述测序文库采用Qubit检测进行质检。与现有技术比较本专利技术的有益效果在于：本专利技术测序质量良好，通过本专利技术得到的样本比对到新冠基因组时，可实现最高达94.16％的reads比对率，从而可以辅助判定患者的感染情况，可实现新型冠状病毒的快速精准检测。附图说明图1为所述新型冠状病毒的快速检测方法的流程示意图；图2为针对新冠病毒全基因组序列29903碱基的扩增片段图；图3为使用特异引物进行片段扩增的电泳图；图4为实施例二患者三次PCR的结果图；图5为实施例二患者提取样本的基因组序列比对图；图6为实施例二患者提取样本通过本专利技术进行检测的测序结果图；图7为实施例二患者提取样本通过本专利技术进行检测的累计产量图；图8为实施例二不同读长下碱基数目分布柱状图；图9为实施例二不同读长下测序质量分布图；图10为实施例二样本过滤后序列与比对新冠基因组后序列情况图；图11为实施例二样本过滤后序列与新冠基因组比对的IGV可视化图；图12为实施例二样本canu组装结果的nt库比对情况图；图13为实施例二样本与2019-nCoV基因组的mummer对比结果图；图14为实施例二样本和新冠、SARS同时比对的结果图；图15为实施例二样本一致性序列与2019-nCoV基因组的比对图。具体实施方式以下结合附图，对本专利技术上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。实施例一如图1所示，图1为所述新型冠状病毒的快速检测方法的流程示意图；本专利技术所述新型冠状病毒的快速检测方法，包括步骤：...

【技术保护点】
1.一种用于新型冠状病毒检测的特异引物，其特征在于，包括49组引物对，所述引物对如下列表所述：/n

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒检测的特异引物，其特征在于，包括49组引物对，所述引物对如下列表所述：








2.一种快速检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1，对采集样本进行灭活，并提取病毒RNA；
S2，将经所述步骤S1提取质检合格的病毒RNA反转进行eDNA合成；
S3，使用如权利要求1所述的特异引物进行片段扩增形成PCR反应产物样品；
S4，对所述PCR反应产物样品进行标识，并构建测序文库；
S5，所述测序文库进行纳米孔测序操作。


3.如权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，在所述步骤S1中，提取的病毒RNA浓度满足吸光度为A260/A280状态下比值在1.9到2.0之间为合格。


4.如权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，在所述步骤S2中利用随机引物以提取的病毒RNA为模板进行cDNA合成。


5.如权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，将49组所述特异引物对根据引物对序号按照奇偶序号分成两组混在一起，生成所述第一基因特异性引物池和所述第二基因特异性引物池，通过混合5μL的100μM的奇号引物对最终形成100μM的125μL的所述第一基因特异性引物池，然后通过超纯水稀释形成10μM的第一工作液，通过混合5μL的100μM的偶序号引物对最终形成100μM的120μL的所述第二基因特异性引物池，然后通过超纯水稀释形成10μM的第二工作液。


6.如权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于，将所述步骤S2的cDNA进行多重PCR扩增，反应体系为：12.5μL的2x高准确率超保真DNA聚合酶反应液、3.6μL的所述第一工作液或所述第二工作液、6.4μL的无核酸酶水和2.5μL的cDNA，共计25μL的所述反应体系；
多重PCR反应条件为：98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火及延伸1分钟，随后在初始病毒RNA样本ct值为18～21时循环25次，在初始病毒RNA样本ct值为18～21时循环35次，最后在65℃延伸5分钟，最终形成PCR反应产物，结束反应；
PCR反应产物纯化和质检：在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶枫，李征途，余乐，陈灵丹，卢文菊，刘婷婷，李寅虎，赵志强，李少强，占扬清，成静，陈莉延，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，广州呼吸健康研究院，北京源生康泰基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44