一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒。引物包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示的引物；同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ分别包括如SEQ ID NO.5～6或SEQ ID NO.7～8所示的引物，且体系Ⅰ和体系Ⅱ含有的引物不同。本发明专利技术通过设计两组引物体系，通过一批次的检测就能够有效的将AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒完全的检测出来，同时还能够避免引物之间的相互干扰。

【技术实现步骤摘要】
一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物、试剂盒以及检测方法。
技术介绍
植物病毒是一种由核酸和蛋白质组成的具有侵染活性的细胞内寄生病原物，据国际病毒分类委员会(ICTV)的第八次报告，目前全世界发现的植物病毒种类达1122个。植物病毒所引起的植物病害素有“植物癌症”之称，其对农作物的危害程度仅次于真菌病原物，几乎每种农作物都受到2～3种病毒的危害。全世界每年由植物病毒造成的损失约4百亿美元，仅烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)造成的危害就超过1亿美元。猕猴桃是全球重要的园艺产品之一，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐。2017年，世界猕猴桃产量已达到403万吨，但病害的侵染会影响猕猴桃的产量和质量，甚至影响猕猴桃产业的健康发展。病毒病是一种潜伏期长、在生产上存在巨大隐患的病害。而猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidiachloroticringspotsassociatedvirus,ACRaV)、黄瓜花叶病毒病(Cucumbermosaicvirus,CMV)、猕猴桃病毒A(ActinidiavirusA,AcVA)、猕猴桃病毒B(ActinidiavirusB，AcVB)均能在自然条件下该病毒可侵染猕猴桃，对果树和猕猴桃的正常生长发育产生一定的影响。同时，我国在湖北，陕西，四川等地区的猕猴桃栽品种中均有检测到该病毒。但目前未见能够同时对4种病毒进行检测，且引物相互之间不会存在干扰的报道。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒，能够检测出AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒，且引物特异性好，灵敏度高。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQIDNO.1～2和SEQIDNO.3～4所示的引物；同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ均还包括如SEQIDNO.5～6或SEQIDNO.7～8所示的引物；且SEQIDNO.5～6和SEQIDNO.7～8所示的引物不同时出现在体系Ⅰ和体系Ⅱ中；即体系Ⅰ中含有SEQIDNO.5～6所示引物时，体系Ⅱ中就不会有SEQIDNO.5～6所示引物，而是含有SEQIDNO.7～8所示的引物。引物具体序列如下所示：AcVB-F：5’-GTTTGCGAGGAGACGTAGGGC-3’(SEQIDNO.1)；AcVB-R：5’-AGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTG-3’(SEQIDNO.2)；CMV-F：5’-GCCGCCATCTCTGCTATGTT-3’(SEQIDNO.3)；CMV-R：5’-GAATGCGTTGGTGCTCGATG-3’(SEQIDNO.4)；AcVA-F：5’-CATGGCAAAGAATATCTCAAG-3’(SEQIDNO.5)；AcVA-R：5’-AGATCCAACCCAGAGTTGAAA-3’(SEQIDNO.6)；AcCRaV-F：5’-GCTTGCAAGATGTCGATGCAG-3’(SEQIDNO.7)；AcCRaV-R：5’-TGCAGGGTCTGCTGCTTATTA-3’(SEQIDNO.8)；进一步地，体系Ⅰ包括如SEQIDNO.1～6所示的引物；体系Ⅱ包括如SEQIDNO.1～4和SEQIDNO.7～8所示的引物。进一步地，体系Ⅰ包括如SEQIDNO.1～6所示的引物；体系Ⅱ包括如SEQIDNO.7～8所示的引物。进一步地，体系Ⅰ包括如SEQIDNO.5～6所示的引物；体系Ⅱ包括如SEQIDNO.1～4和SEQIDNO.7～8所示的引物。一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，包括以下步骤：(1)采集带病样本，然后提取其总RNA，并反转录得到cDNA；(2)以权利要求1的体系Ⅰ和体系Ⅱ的引物分别进行PCR扩增即可。进一步地，采集带病样本后，根据样本表现出的患病症状，选择相应体系Ⅰ或体系Ⅱ的引物体系进行初步检测，然后再用剩余体系的引物进行补充检测。进一步地，PCR反应体系包括：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、cDNA1.0μL，体系Ⅰ所述引物或体系Ⅱ所述引物1.0μL，最后补ddH2O至25μL。进一步地，体系Ⅰ中各引物以等比例浓度添加；体系Ⅱ中SEQIDNO.1～2所述引物浓度为其余引物浓度的5倍，且其余引物以等比例浓度添加。进一步地，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸40s；35个循环；72℃延伸10min。一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的引物。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过设计两组引物体系，通过一批次的检测就能够有效的将AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒完全的检测出来，同时还能够避免引物之间的相互干扰，且引物也具有很高的灵敏度。附图说明图1为各引物特异性检测结果；图2为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R引物体系的灵敏度检测结果；图3为AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系的灵敏度检测结果；图4为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R引物体系，以及AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系对四种病毒的特异性检测结果。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。实施例1、样本采集从四川猕猴桃种植区采集具有典型泡状收缩、环状斑、黄色斑、萎黄斑、狭长变形、叶脉发黄、坏死等症状的叶片。叶片样本与无水氯化钙一起储存在干瓶中，4℃保存。新鲜叶片样品保存在-80℃的冰箱中。2、总RNA提取植物组织样品(0.1g)用2mL灭菌离心管在液氮中研磨，用苯酚、氯仿、异戊醇(v：v：v，25：24：1)(500μL)和RNA缓冲液(500μL)提取。离心后，将上清液(约400μL)与2倍体积的4M氯化锂溶液混合，在-20℃下孵育至少8小时，然后在4℃下，12，000rpm离心10min，回收颗粒中的RNA。球团用70％乙醇在4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；所述体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQ ID NO.1～2和SEQ IDNO.3～4所示的引物；/n同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ均还包括如SEQ ID NO.5～6或SEQ ID NO.7～8所示的引物；且SEQ ID NO.5～6和SEQ ID NO.7～8所示的引物不同时出现在体系Ⅰ和体系Ⅱ中。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；所述体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQIDNO.1～2和SEQIDNO.3～4所示的引物；
同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ均还包括如SEQIDNO.5～6或SEQIDNO.7～8所示的引物；且SEQIDNO.5～6和SEQIDNO.7～8所示的引物不同时出现在体系Ⅰ和体系Ⅱ中。


2.根据权利要求1所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，所述体系Ⅰ包括如SEQIDNO.1～6所示的引物；所述体系Ⅱ包括如SEQIDNO.1～4和SEQIDNO.7～8所示的引物。


3.根据权利要求1所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，所述体系Ⅰ包括如SEQIDNO.1～6所示的引物；所述体系Ⅱ包括如SEQIDNO.7～8所示的引物。


4.根据权利要求1所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，所述体系Ⅰ包括如SEQIDNO.5～6所示的引物；所述体系Ⅱ包括如SEQIDNO.1～4和SEQIDNO.7～8所示的引物。


5.一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集带病样本，然后提取其总RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚静，薛冰，张敏，贾琦，龚国淑，陈华保，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51