一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒由20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)组成，其中PCR反应混合物包含引物序列Primer:F 5’‑CTGGCATAGGACGGAGTA‑3’，R 5’‑CGCAACATTCGCATCTAC‑3，所述试剂盒的有益效果为引物序列高度保守，可以检测不同来源，突变的非洲猪瘟病毒，可以更好的应对非洲猪瘟病毒突变。

An African classical swine fever virus detection kit

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪痘病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)感染引起的，巧猪、豪猪、野猪及家养猪易感，猪一旦感染后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％，虽然无该病毒感染人的报道，但发生该病后对养猪业带来极大的危害，动物产品的销售、贸易等均受到严重限制，因此世界动物卫生组织将其列为法定上报的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中，也被列为一类动物疾病。ASFV二十面体对称，病毒粒子直径200nm，结构呈同心球状，最中央区域为核质体，其直径约80nm，由病毒基因组、完成基因早期转录所必需的酶以及一些DNA结合蛋白组成，如p150、p37、p34、p14以及p14.5、p10，核质体外围是一些蛋白组成的核衣壳，壳粒是其基本结构单位，共有1982-2172个。1921年，ASF最早在肯尼亚出现，随后的几十年里该病发生于撒哈拉沙漠周边一些国家，1957年非洲大陆外的葡萄牙国家首次爆发该病，葡萄牙的这次ASF发生后很快就被控制和消灭掉，到了1960年，里斯本附近地区又爆发了ASF，从该病爆发开始到1995年，ASFV在伊比利亚半岛(西班牙和葡萄牙)的许多地区蔓延，上世纪70年代末到80年代中后期，ASFV迅速扩散到世界其他的地方，其中影响较大的是另外一些欧洲国家(如意大利、法国、荷兰、比利时等)和美洲的一些国家，多米尼加共和国和巴西尤其严重。通过追根溯源发现，给健康猪饲喂污染ASFV的机场和港口的泔水，是造成ASFV从疫区国家传播到无疫病国家的主要原因。一旦猪群感染，发病猪及猪肉制品立马成为新的病毒传染源。西班牙ASFV的流行病学资料显示，控制措施如果能落实到位，ASF还是可以清除的，然而在意大利的撒丁岛和非洲大陆，特别是非洲东南部地区，该病毒仍持续存在。上世纪90年代到本世纪初，ASF的流行病学和分布情况发生了改变，开始进入其他的一些地区，包括一些西非国家；1996年科特迪瓦发生ASF，1997年尼日利亚和多哥发生ASF，1999年加纳发生ASF，2003年布基纳法索发生ASF，2010年乍得发生ASF等；在西非发生的同时，马达加斯加和毛里求斯这样的岛屿国家也出现了ASF的流行；2007年，格鲁吉亚首次发生了ASF，随后向西北方向流行，再次进入欧洲大陆。到目前为止，ASF己在非洲、美洲、欧洲及欧亚大陆交界处等许多国家流行，2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟疫情，2018年之前，中国没有非洲猪瘟。分子流行病学研究表明：传入中国的非洲猪瘟病毒属基因Ⅱ型，与格鲁吉亚、俄罗斯、波兰公布的毒株全基因组序列同源性为99.95％左右，通常非洲猪瘟跨国境传入的途径主要有四类：一是生猪及其产品国际贸易和走私，二是国际旅客携带的猪肉及其产品，三是国际运输工具上的餐厨剩余物，四是野猪迁徙。中国已查明疫源的68起家猪疫情，传播途径主要有三种：一是生猪及其产品跨区域调运，占全部疫情约19％；二是餐厨剩余物喂猪，占全部疫情约34％；三是人员与车辆带毒传播，这是当前疫情扩散的最主要方式，占全部疫情约46％。PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，用于检测各种组织、体液中病原微生物的核酸，与其它试验相比，此方法更加快速、敏感，且不需要分离培养病原微生物，并能进行大批量的流行病学调查，Steiger等首先根据ASFVDNA保守区序列设计一对PCR引物，用建立的PCR检测细胞培养和感染组织中的ASFV核酸，虽然该对引物检测时灵敏高，但在血液样品检测时，可能会检出假阳性，并伴有非特异性条带产生，本专利技术的目的在于提供一种PCR检测方法，具有高度的特异性和能适应ASFV变异的性能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供适宜ASFV变异的PCR诊断试剂盒，其具有高度保守的引物序列，可以更好的应对ASFV的变异以及具有高度的特异性。本专利技术的制备和使用过程如下：1.从NCBI上获得非洲猪瘟序列，通过NCBIBlast功能，获得保守序列，比对结果见图1；2.使用PrimerPremier6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3，扩增区域94354-94632，长度279bp；3.样品处理选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-20℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入5mlPBS缓冲液(pH值为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；4.样品DNA模板提取将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；5.试剂盒组成20支PCR反应管、300μlPCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μlTaq酶(5U/μl)；6.PCR扩增取步骤四样品5μl，加入15μlPCR反应混合物、1UTaq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现预定大小的荧光带即为阳性。本专利技术的有益效果是：获得了非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒的引物序列高度保守，可以检测不同来源，突变的非洲猪瘟病毒，可以更好的应对非洲猪瘟病毒突变。附图说明图1序列对比图图2特异性检验结果图图3不同种类非洲猪瘟病毒检测图4敏感性检验结果图具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。实施例1本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；表1实验材料和试剂表2实验仪器设备AB104-N电子分析天平梅特勒-托利多上海有限公司PTC-200型PCR仪美国MJResearch公司DYY-6D型核酸电泳仪北京市六一仪器厂GelDoc凝胶成像系统美国Bio-Rad公司Sigma3K-15高速冷冻离心机德国Sigma公司MilliQIntegral超纯水仪美国Milipore公司1.从NCBI上获得非洲猪瘟序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒包括：20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)，其中PCR反应混合物包含引物序列：Primer:F 5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3；/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒包括：20支PCR反应管、300μlPCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μlTaq酶(5U/μl)，其中PCR反应混合物包含引物序列：Primer:F5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3；


2.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒的制备和使用过程如下：
1)从NCBI上获得非洲猪瘟序列，通过NCBIBlast功能，获得保守序列；
2)使用PrimerPremier6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3，扩增区域94354-94632，长度279bp；
3)样品处理
选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶繁全，
申请(专利权)人：叶繁全，
类型：发明
国别省市：广东;44