一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法技术

本发明专利技术公开了一种用于2019‑nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法，涉及病毒体外核酸检测技术领域。用于2019‑nCoV检测的核酸组合物为正向引物、反向引物及探针；用于2019‑nCoV检测的检测试剂盒中包含该核酸组合物，还包括酶混合物和PCR MIX，该检测试剂盒可制备成液态，也可制备成粉态；本发明专利技术中粉态的检测试剂盒的生产方法包括混合和冻干步骤。本发明专利技术中的核酸组合物及试剂盒可对2019‑nCoV基因序列上的ORF3中的目标基因进行特异性扩增，且检测灵敏度高，还能够对病毒的初始拷贝数进行准确定量，可广泛用于2019‑nCoV核酸检测。

A nucleic acid composition, kit and production method for 2019 ncov detection

【技术实现步骤摘要】
一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法
本专利技术涉及病毒体外核酸检测
，更具体地说，它涉及一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法。
技术介绍
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。此次疫情传染性强，临床上以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状，部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，病情危重者可导致死亡。2020年1月12日，世界卫生组织将引起本次病毒性肺炎病例的病原体命名为2019-nCoV，即2019新型冠状病毒。2019-nCoV属于β属的新型冠状病毒，为RNA病毒，其有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状，另外2种是致病性较高的SARS冠状病毒和MERS冠状病毒。核酸检测是临床病原学诊断的常用方法，其具有灵敏高、特异性强等优点。新型冠状病毒肺炎疫情发生以来，核酸检测是临床诊断、解除隔离、康复出院的重要诊断依据。基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR技术具有简单、快速、准确的优势，已广泛应用于临床病原体的检测，曾在2003年爆发的SRAS病毒的疫情控制方面做出过重要贡献，是WHO推荐的MERS-CoV病毒检测方法之一，目前，实时荧光RT-PCR技术已被列入我国2019-nCoV诊疗指南。为了助力2019-nCoV引起的肺炎疫情的检疫和防控工作，自疫情发生以来，国内外陆续涌现出了2019-nCoV核酸检测试剂盒，如公开号为CN110982945A的中国专利中公开的一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法，公开号为CN111074008A的中国专利中公开的一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法等。但是，从目前临床实际使用情况来看，现有的核酸检测试剂盒仍然存在假阴性的情况，会造成漏检，给疫情防控带来很大的隐患。其假阴性的原因可能是实时荧光定量检测病毒时，由于使用的引物或探针的特异性不高，导致了无法特异性地扩增出目标基因，因此无法检测出样本中的病毒信号。鉴于此，目前本领域的技术人员仍需继续研发特异性高的核酸检测方案，以改善现有的核酸检测试剂盒存在的假阴性问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，其引物和探针易于特异性地扩增出样本中的目标基因，对样本具有准确的2019-nCoV病毒检测能力。本专利技术的第二个目的在于提供一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其能够特异、灵敏地检测出样本中的2019-nCoV病毒，且试剂盒使用起来操作简单、操作步骤少、失误率低，检测效率高。本专利技术的第三个目的在于提供一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒生产方法，其选择冻干法生产用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，使得本专利技术中的检测试剂盒具有即用即溶解、使用方便、不易降解、便于长途运输的优势。为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，所述核酸组合物包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQIDNO.1所示；所述反向引物的序列如SEQIDNO.2所示；所述探针的序列如SEQIDNO.3所示；所述探针的5’端采用荧光报告基团修饰，所述探针的3’端采用荧光淬灭基团修饰。通过采用上述技术方案，本方案中将2019-nCoV的全基因组序列与其他6种冠状病毒的全基因组序列进行比对分析，在2019-nCoV基因序列中的开放读码框ORF3的基因上针对性地设计了正向引物、反向引物和探针，能够特异性地扩增ORF3上的目标基因，从而特异性地指示被测样本中的2019-nCoV。同时，在NCBI数据库里primer-blast扩增引物对新冠病毒以外的物种无匹配的结果，说明引物对其他物种无扩增，特异性良好，因此，以本方案中的正、反向引物和探针扩增样本时，能够特异性地扩增出样本中的目标基因，从而准确指示2019-nCoV的有无，减少核酸检测时假阴性的情况发生，进而减少疫情防控中的漏检情况。通过探针上荧光报告基团和荧光淬灭基团的引入，无PCR扩增时，荧光淬灭基团能够淬灭荧光报告基团，无荧光信号；在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性能够对探针进行酶切，使得荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光报告基团得以报告荧光信号，从而指示出样本中存在目标基因的扩增。随着PCR产物的增加，荧光信号也等比例增加，从而可以通过荧光信号的出现与否判读样本中是否出现了目标基因的扩增，以快速指示样本中有无2019-nCoV。同时，还可以通过荧光信号定量样本中2019-nCoV的起始拷贝数，以指示样本中的病毒量。为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，包括上述的正向引物、反向引物和探针，且所述正向引物、反向引物和探针独立包装，还包括酶混合物和PCRMIX。通过采用上述技术方案，能够将合成的核酸组合物较长时间地保存于试剂盒中，使得疫情防控期间对2019-nCoV临床检测使用时更加方便。同时，正向引物、反向引物和探针独立包装的设置，能够减少本方案中的试剂盒在存储过程中正向引物、反向引物及探针之间发生聚合而失效的几率。进一步地，所述正向引物、反向引物及探针为液态，所述酶混合物和PCRMIX为液态，所述PCRMIX中包含有PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。通过采用上述技术方案，液态的组分制备起来工序简单，制备成本低且制备速度快，便于检测试剂盒的大批量生产，符合当前新型冠状病毒肺炎疫情的防疫需求。通过酶混合物和PCRMIX的加入，当样本中存在2019-nCoV时，正向引物和反向引物及探针能够以dNTPs为原料，在酶混合物的促进下完成链延伸，从而实现目标基因反转录和扩增的效果。通过PCR缓冲液的加入，能够平衡PCR反应的酸碱度，以便反应正常进行。通过阳离子的加入，能够对PCR扩增的特异性和产量起到促进效果。进一步地，所述正向引物、反向引物和探针为粉态，所述酶混合物和所述PCRMIX均为粉态，检测试剂盒内还包括粉态的冻干保护剂，粉态的核酸组合物、粉态的酶混合物、粉态的PCRMIX及粉态的冻干保护剂混合后冻干形成冻干粉反应试剂置于检测试剂盒内。通过采用上述技术方案，为检测试剂盒提供了另一种剂型，虽然粉态的冻干粉反应试剂制备时加工工序多于液态，但是粉态的冻干粉反应试剂成品易于保存，易于运输，且使用时不容易发生交叉污染，使用起来相对于液态试剂会更加便捷。同时，本方案中的冻干粉反应试剂将检测试剂盒中的所有组分混匀后冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，所述核酸组合物包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；/n所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；/n所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；/n所述探针的5’端采用荧光报告基团修饰，所述探针的3’端采用荧光淬灭基团修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，所述核酸组合物包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQIDNO.1所示；
所述反向引物的序列如SEQIDNO.2所示；
所述探针的序列如SEQIDNO.3所示；
所述探针的5’端采用荧光报告基团修饰，所述探针的3’端采用荧光淬灭基团修饰。


2.一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的正向引物、反向引物和探针，且所述正向引物、反向引物和探针独立包装，还包括酶混合物和PCRMIX。


3.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物、反向引物及探针为液态，所述酶混合物和PCRMIX为液态，所述PCRMIX中包含有PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。


4.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物、反向引物和探针为粉态，所述酶混合物和所述PCRMIX均为粉态，检测试剂盒内还包括粉态的冻干保护剂，粉态的核酸组合物、粉态的酶混合物、粉态的PCRMIX及粉态的冻干保护剂混合后冻干形成冻干粉反应试剂置于检测试剂盒内。


5.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合物中包含有RNA酶抑制剂。


6.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒内还包括阳性对照品，所述阳性对照品为含有目标基因序列的假病毒。


7.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树文，葛斌文，
申请(专利权)人：南京黎明生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32