多效应核碱基编辑器和使用其修饰核酸靶序列的方法技术

本发明专利技术的特征在于能够在靶核酸内的多个不同碱基处诱导改变的多效应核碱基编辑器，以及使用这种编辑器的方法。及使用这种编辑器的方法。及使用这种编辑器的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多效应核碱基编辑器和使用其修饰核酸靶序列的方法
[0001]相关申请案
[0002]本申请主张2018年8月3日提交的美国临时申请号62/714,550的效益，其整体内容通过引用并入本文，且以本申请中的术语定义为准。


[0003]核酸序列的靶向编辑，例如靶向切割或向基因组DNA定向导入特定修饰，是研究基因功能的一种很有前途的方法，也具有为人类遗传疾病提供新疗法的潜力。当前可用的碱基编辑器包括将目标C
·
G转换为T
·
A的胞苷碱基编辑器(例如BE4)和将目标A
·
T转换为G
·
C的腺嘌呤碱基编辑器(例如ABE7.10)。在本领域中需要能够在靶序列内诱导新颖类型的修饰的碱基编辑器。

技术实现思路

[0004]如下所述，本专利技术的特征在于能够在靶核酸内的多个不同碱基上引起变化的多效应核碱基编辑器，以及使用这种编辑器的方法。
[0005]在一个方面，本专利技术的特征在于一种多效应核碱基编辑器多肽，其包含腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶和/或DNA糖基化酶结构域，其中上述结构域与多核苷酸结合结构域融合，从而形成能够诱导核酸分子中多个不同碱基的变化。在一个实施方案中，所述多肽进一步包含一个或多个核定位信号(NLS)。在另一个实施方案中，NLS是二分NLS。在另一个实施方案中，多肽包含N末端NLS和C末端NLS。在另一个实施方案中，所述多肽进一步包含一种或多种尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)。在另一个实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。在另一个实施方案中，TadA脱氨酶是自然界中不存在的修饰的腺苷脱氨酶。在另一个实施方案中，所述多肽包含两个相同或不同的腺苷脱氨酶。在另一个实施方案中，两个腺苷脱氨酶能够形成异源或同源二聚体。在另一个实施方案中，腺苷脱氨酶结构域是野生型TadA和TadA7.10。在另一个实施方案中，具有核酸序列特异性结合活性的结构域是核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)。在另一个实施方案中，napDNAbp结构域包含核酸酶死亡的Cas9(dCas9)、Cas9切口酶(nCas9)或核酸酶活性Cas9。在另一个实施方案中，napDNAbp选自Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h和Cas12i或其活性片段。在某些实施方案中，napDNAbp结构域包含Cas9结构域、Cas12a结构域、Cas12b结构域、Cas12c结构域、Cas12d结构域、Cas12e结构域、Cas12f结构域、Cas12g结构域、Cas12h结构域、Cas12i结构域或argonaute结构域。在另一个实施方案中，napDNAbp结构域包含能够切割核酸序列的反向互补链的催化结构域。在另一个实施方案中，napDNAbp结构域不包含能够切割核酸序列的催化结构域。在另一个实施方案中，Cas9是dCas9或nCas9。在另一个实施方案中，胞苷脱氨酶是海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶1(pCDM)或激活诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)。在另一个实施方案中，多肽还包含无碱基核碱基编辑器。在另一个实施方案中，UGI衍生自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS1，并抑制人UDG活性。
[0006]在另一方面，本专利技术的特征在于多效应核碱基编辑器多肽，其包含一个或多个核
定位信号(NLS)、napDNAbp、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂、腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶。在一个实施方案中，所述多肽包含两个NLS。在一个实施方案中，一个NLS是二分NLS。在另一个实施方案中，所述多肽包含两种尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂。在另一个实施方案中，所述多肽包含两个腺苷脱氨酶和一个胞苷脱氨酶、或一个无碱基核碱基编辑器和一个胞苷脱氨酶、或一个无碱基核苷编辑器和一个腺苷脱氨酶。
[0007]一方面，本专利技术的特征在于一种多效应核碱基编辑器多肽，其包含以下结构域A
‑
C，A
‑
D或A
‑
E：
[0008]NH2‑
[A
‑
B
‑
C]‑
COOH，
[0009]NH2‑
[A
‑
B
‑
C
‑
D]‑
COOH，或
[0010]NH2‑
[A
‑
B
‑
C
‑
D
‑
E]‑
COOH
[0011]其中A和C或A、C和E各自包含以下一种或多种：
[0012]腺苷脱氨酶结构域或其活性片段、
[0013]胞苷脱氨酶结构域或其活性片段、
[0014]DNA糖基化酶结构域或其活性片段；和
[0015]其中B或B和D各自包含一个或多个具有核酸序列特异性结合活性的结构域。在一个实施方案中，前述方面的多效应物核碱基Editor多肽包含：
[0016]NH2‑
[A
n
‑
B
o
‑
C
n
]‑
COOH，
[0017]NH2‑
[A
n
‑
B
o
‑
C
n
‑
D
o
]‑
COOH，或
[0018]NH2‑
[A
n
‑
B
o
‑
C
p
‑
D
o
‑
E
q
]‑
COOH；
[0019]其中A和C或A、C和E各自包含以下一种或多种：
[0020]腺苷脱氨酶结构域或其活性片段、
[0021]胞苷脱氨酶结构域或其活性片段、
[0022]DNA糖基化酶结构域或其活性片段；和
[0023]其中n是整数：1、2、3、4或5，其中p是整数：0、1、2、3、4或5；其中q是0、1、2、3、4或5的整数；其中B或B和D各自包含具有核酸序列特异性结合活性的结构域；其中o是1、2、3、4或5的整数。在一个实施方案中，所述多肽含有一个或多个核定位序列。在一个实施方案中，所述多肽含有至少一个所述核定位序列在N末端或C末端。在一个实施方案中，包含所述核定位信号的所述多肽是二分核定位信号。在一个实施方案中，所述多肽包含一个或多个通过连接子连接的结构域。在一个实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。在一个实施方案中，所述TadA是自然界中不存在的修饰的腺苷脱氨酶。在另一个实施方案中，所述多肽包含两个相同或不同的腺苷脱氨酶结构域。在一实施方案中，所述两个腺苷脱氨酶结构域能够形成异源或同二聚体。在一个实施方案中，所述腺苷脱氨酶结构域是野生型TadA和TadA7.10。在一个实施方案中，所述多肽包含具有核酸序列特异性结合活性的结构域是核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多效应核碱基编辑器多肽，其包含具有核酸序列特异性结合活性的结构域和两个或更多个选自由腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶和无碱基编辑器组成的群组的核碱基编辑器结构域。2.根据权利要求1所述的多肽，其进一步包含一个或多个核定位信号(NLS)。3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述NLS是二分NLS。4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽包含N末端NLS和C末端NLS。5.根据权利要求1所述的多肽，其进一步包含一种或多种尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)。6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述核碱基编辑器包含腺苷脱氨酶或其催化活性片段。7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述TadA脱氨酶是自然界中不存在的修饰的腺苷脱氨酶。9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含两个相同或不同的腺苷脱氨酶。10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述两个腺苷脱氨基酶能够形成异源二聚体或同源二聚体。11.根据权利要求10所述的多肽，其中所述两个腺苷脱氨酶结构域是野生型TadA和TadA7.10。12.根据权利要求1所述的多肽，其中具有核酸序列特异性结合活性的结构域是核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)。13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述napDNAbp结构域包含核酸酶死亡的Cas9(dCas9)、Cas9切口酶(nCas9)或核酸酶活性Cas9。14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述napDNAbp是选自由Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h和Cas12i或其活性片段组成的群组。15.根据权利要求14所述的多肽，其中所述napDNAbp结构域包含催化结构域，其能够切割核酸序列的反向互补链。16.根据权利要求14所述的多肽，其中所述napDNAbp结构域不包含能够切割核酸序列的催化结构域。17.根据权利要求14所述的多肽，其中所述Cas9是dCas9或nCas9。18.根据权利要求14所述的多肽，其中所述Cas9是dCas9。19.根据权利要求14所述的多肽，其中所述Cas9是nCas9。20.根据权利要求1所述的多肽，其中所述胞苷脱氨酶是海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶1(pCDM)或活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)。21.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含无碱基核碱基编辑器。22.根据权利要求5所述的多肽，其中所述一种或多种UGI衍生自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS1，并抑制人类UDG活性。23.一种多效应核碱基编辑器多肽，其包含一个或多个核定位信号(NLS)、napDNAbp、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂、腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶。
24.根据权利要求23所述的多肽，其中所述多肽包含两个NLS。25.根据权利要求23所述的多肽，其中一个NLS是二分NLS。26.根据权利要求23所述的多肽，其中所述多肽包含两个尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂。27.根据权利要求23所述的多肽，其中所述多肽包含两个腺苷脱氨酶和一个胞苷脱氨酶，或一个无碱基核碱基编辑器和一个胞苷脱氨酶，或一个无碱基核碱基编辑器和一个腺苷脱氨酶。28.一种包含以下结构域A
‑
C、A
‑
D或A
‑
E的多效应核碱基编辑器多肽：NH2‑
[A
‑
B
‑
C]
‑
COOH，NH2‑
[A
‑
B
‑
C
‑
D]
‑
COOH，或NH2‑
[A
‑
B
‑
C
‑
D
‑
E]
‑
COOH其中A和C或A、C和E各自包含以下一种或多种：腺苷脱氨酶结构域或其活性片段，胞苷脱氨酶结构域或其活性片段，DNA糖基化酶结构域或其活性片段；和其中B或B和D各自包含一个或多个具有核酸序列特异性结合活性的结构域。29.根据权利要求28所述的多效应核碱基编辑器多肽，其包含：NH2‑
[A
n
‑
B
o
‑
C
n
]
‑
COOH，NH2‑
[A
n
‑
B
o
‑
C
n
‑
D
o
]
‑
COOH，或NH2‑
[A
n
‑
B
o
‑
C
p
‑
D
o
‑
E
q
]
‑
COOH；其中A和C或A、C和E各自包含以下一种或多种：腺苷脱氨酶结构域或其活性片段，胞苷脱氨酶结构域或其活性片段，和DNA糖基化酶结构域或其活性片段；和其中n是整数：1、2、3、4或5，其中p是整数：0、1、2、3、4或5；其中q是0、1、2、3、4或5的整数；和其中B或B和D各自包含具...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：比姆医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：