【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、原位肝移植(olt)是治疗终末期肝病、急性肝衰竭和基于肝脏的代谢紊乱的金标准。olt有几个主要缺点，包括供体器官稀缺、手术相关并发症的风险、手术费用高以及需要终生免疫抑制。
2、肝细胞移植(ht)是非常有吸引力且临床安全的olt替代方案，因为它侵入性较小且成本较低，并且如果需要可以重复进行。ht的局限性与高质量肝细胞的供应有限以及同种异体移植物的移植/长期接受度不足有关。虽然在接受同种异体肝细胞移植的患者中看到了令人鼓舞的临床改善，尽管有免疫抑制,但长期功效仍然受到细胞同种异体移植物的长期接受度有限的阻碍。
技术实现思路
1、人原代肝细胞具有高度免疫原性，因此需要在移植前进行替代性免疫调节策略以改善肝细胞的移植。目前使用肝细胞治疗肝病存在一些障碍。它们通常是：1)人肝细胞供应有限；以及2)受试者肝细胞移植不足。高质量肝细胞的供应有限至少部分地是由于可从中分离出高质量肝细胞的供体肝脏供应有限。作为肝细胞生物反应器的人源化动物模型的生产和使用，使得人肝细胞的获取和扩增对于项目规模开发来说是可行的。上面提到的第二个障碍是，尽管有免疫抑制，但移植不足迄今为止仍限制了细胞同种异体移植物的长期接受度。本专利技术人令人惊讶地发现了基因修饰肝细胞的独特方法，其使得基因修饰的肝细胞适合施用于有此需要的受试者。
2、在一些方面，提供了生产适用于肝细胞移植的基因修饰的人肝细胞的方法，该方法包括：通过引入碱基编辑器以及一种或多种与一个或多个i类或ii类基因中的靶序列
3、在一些实施例中，碱基编辑器包含融合至脱氨酶的crispr蛋白。
4、在一些实施例中，基因修饰的人肝细胞在靶序列中具有一个或多个核碱基编辑。例如，基因修饰可以具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个核碱基编辑。
5、在一些实施例中，基因修饰的人肝细胞具有经破坏的靶序列。在一些实施例中，经破坏的靶序列导致靶基因的表达降低。在一些实施例中，经破坏的靶序列导致靶基因的表达增加。
6、在一些实施例中，基因修饰的人肝细胞具有降低或消除的同种异体反应性。因此，在一些实施例中，基因修饰的人肝细胞具有降低的同种异体反应性。在一些实施例中，基因修饰的人肝细胞具有消除的同种异体反应性。“消除”意指通过使用本领域已知的方法不存在可检测的同种异体反应性。
7、在一些实施例中，i类或ii类基因选自b2m、cd142、ciita、hla-a或hla-b基因中的一种或多种。因此，在一些实施例中，i类或ii类基因是b2m。在一些实施例中，i类或ii类基因是cd142。在一些实施例中，i类或ii类基因是ciita。在一些实施例中，i类或ii类基因是hla-a。在一些实施例中，i类或ii类基因是hla-b。
8、在一些实施例中，将终止密码子或剪接位点引入到b2m、cd142、ciita、hla-a或hla-b基因中的一种或多种中。因此，在一些实施例中，将终止密码子引入到b2m、cd142、ciita、hla-a或hla-b基因中的一种或多种中。在一些实施例中，将剪接位点引入到b2m、cd142、ciita、hla-a或hla-b基因中的一种或多种中。
9、在一些实施例中，在b2m基因的核苷酸位置19处引入剪接位点。
10、在一些实施例中，在b2m基因的核苷酸位置5处引入终止密码子。
11、在一些实施例中，在cd142基因的核苷酸位置28处引入剪接位点。
12、在一些实施例中，在cd142基因的核苷酸位置19处引入终止密码子。
13、在一些实施例中，在ciita基因的核苷酸位置147处引入剪接位点。
14、在一些实施例中，在ciita基因的核苷酸位置130处引入终止密码子。
15、在一些实施例中，crispr蛋白是cas9或cas12。因此，在一些实施例中，crispr蛋白是cas9蛋白。在一些实施例中，crispr蛋白是cas12蛋白。
16、在一些实施例中，cas9来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)(spcas9)或金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(sacas9)。因此，在一些实施例中，cas9来自酿脓链球菌(spcas9)。在一些实施例中，cas9来自金黄色葡萄球菌(sacas9)。本领域描述了从多种细菌中获得或修饰的各种cas9蛋白，包括具有突变的cas9。cas9及其突变体描述于各种出版物中，包括例如wo 2013/176772、us10,266,850、wo 2014/093661、wo 2014/093655、wo2014/093595，其内容通过引用并入本文中。
17、各种cas12蛋白是本领域已知的并且包括例如2类v型和vi型蛋白。例如，2类v型cas12包括：cas12a、cas12b、cas12c等。cas12的各种名称已被使用，并包括cpf1、c2c1、c2c1p、c2c3、c2cp3、c2c2p。在本文公开的方法的一些实施例中，使用来自2类v型或vi型蛋白的cas12蛋白。例如，在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括cas12a蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括cas12b蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括cas12c蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括cpf1蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括c2c1蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括c2c1p蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括c2c3蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括c2cp3蛋白。在一些实施例中，用于本文所述方法的合适的cas12包括c2c2p蛋白。wo/2016/205711和wo/2016/205749中描述了各种cas12，其内容通过引用并入。
18、在一些实施例中，cas9蛋白是超精确cas9。在一些实施例中，cas9蛋白包含参考spycas9(seq id no:68)与n692a、m694a、q695a和/或h698a对应的突变。在一些实施例中，cas9蛋白是高保真cas9。在一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产适用于肝细胞移植的基因修饰的人肝细胞的方法，其包括：通过引入碱基编辑器以及一种或多种与一个或多个I类或II类基因中的靶序列杂交的gRNA，来破坏分离的人肝细胞中或肝细胞祖细胞中的一个或多个主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类基因，由此生产基因修饰的人肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱基编辑器包含融合至脱氨酶中的CRISPR蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞在靶序列中具有一个或多个核碱基编辑。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞具有经破坏的靶序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞具有降低或消除的同种异体反应性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述I类或II类基因选自B2M、CD142、CIITA、HLA-A或HLA-B基因中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将终止密码子或剪接位点引入到所述B2M、CD142、CIITA、HLA-A或HLA-B基因中的一种或多种中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在B2M基因的核苷酸位置19处引入剪接位点。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在B2M基因的核苷酸位置5处引入终止密码子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中在CD142基因的核苷酸位置28处引入剪接位点。
11.根据权利要求7所述的方法，其中在CD142基因的核苷酸位置19处引入终止密码子。
12.根据权利要求7所述的方法，其中在CIITA基因的核苷酸位置147处引入剪接位点。
13.根据权利要求7所述的方法，其中在CIITA基因的核苷酸位置130处引入终止密码子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR蛋白是Cas9或Cas12。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Cas9来自酿脓链球菌(SpCas9)或金黄色葡萄球菌(SaCas9)。
16.根据权利要求15所述的Cas9蛋白，其中所述Cas9蛋白是超精确Cas9。
17.根据权利要求15所述的Cas9蛋白，其中所述Cas9蛋白包含参考SpyCas9(SEQ IDNO:68)与N692A、M694A、Q695A和/或H698A对应的突变。
18.根据权利要求15所述的Cas9蛋白，其中所述Cas9蛋白是高保真Cas9。
19.根据权利要求15所述的Cas9蛋白，其中所述Cas9蛋白包含参考SpyCas9(SEQ IDNO:68)与N467A、R661A、Q695A和/或Q926A对应的突变。
20.根据权利要求15所述的Cas9蛋白，其中所述Cas9蛋白是SuperFi-Cas9。
21.根据权利要求15所述的Cas9蛋白，其中与SpyCas9(SEQ ID NO:68)对应的Y1016、R1019、Y1010、Y1013、K1031、Q1027和/或V1018残基突变为天冬氨酸。
22.根据权利要求2至15中任一项所述的方法，其中所述CRISPR蛋白融合至腺嘌呤碱基编辑器(ABE)、胞苷碱基编辑器(CBE)或肌苷碱基编辑器(IBE)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述CRISPR融合至包含腺嘌呤或腺苷脱氨酶结构域或者胞苷或胞嘧啶脱氨酶结构域的碱基编辑器。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述CRISPR融合至包含腺嘌呤或腺苷脱氨酶结构域以及胞苷或胞嘧啶脱氨酶结构域的碱基编辑器。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述CRISPR蛋白包含核定位序列(NLS)和/或FLAG、HIS或HA标签。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述CRISPR蛋白包含SEQ ID NO:1(SpCas9)、SEQ ID NO:2(SaCas9)或SEQ ID NO:3(Cas12)中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个突变。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述突变是氨基酸取代。
28.根据权利要求26或27中任一项所述的方法，其中所述至少一个突变产生核酸酶失活的Cas9(dCas9)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一个突变是Cas9的RuvC结构域和/或HNH结构域中的一个或多个氨基酸取代。
30.根据权利要求29所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种生产适用于肝细胞移植的基因修饰的人肝细胞的方法，其包括：通过引入碱基编辑器以及一种或多种与一个或多个i类或ii类基因中的靶序列杂交的grna，来破坏分离的人肝细胞中或肝细胞祖细胞中的一个或多个主要组织相容性复合体(mhc)i类或ii类基因，由此生产基因修饰的人肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱基编辑器包含融合至脱氨酶中的crispr蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞在靶序列中具有一个或多个核碱基编辑。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞具有经破坏的靶序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞具有降低或消除的同种异体反应性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述i类或ii类基因选自b2m、cd142、ciita、hla-a或hla-b基因中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将终止密码子或剪接位点引入到所述b2m、cd142、ciita、hla-a或hla-b基因中的一种或多种中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在b2m基因的核苷酸位置19处引入剪接位点。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在b2m基因的核苷酸位置5处引入终止密码子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中在cd142基因的核苷酸位置28处引入剪接位点。
11.根据权利要求7所述的方法，其中在cd142基因的核苷酸位置19处引入终止密码子。
12.根据权利要求7所述的方法，其中在ciita基因的核苷酸位置147处引入剪接位点。
13.根据权利要求7所述的方法，其中在ciita基因的核苷酸位置130处引入终止密码子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述crispr蛋白是cas9或cas12。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述cas9来自酿脓链球菌(spcas9)或金黄色葡萄球菌(sacas9)。
16.根据权利要求15所述的cas9蛋白，其中所述cas9蛋白是超精确cas9。
17.根据权利要求15所述的cas9蛋白，其中所述cas9蛋白包含参考spycas9(seq idno:68)与n692a、m694a、q695a和/或h698a对应的突变。
18.根据权利要求15所述的cas9蛋白，其中所述cas9蛋白是高保真cas9。
19.根据权利要求15所述的cas9蛋白，其中所述cas9蛋白包含参考spycas9(seq idno:68)与n467a、r661a、q695a和/或q926a对应的突变。
20.根据权利要求15所述的cas9蛋白，其中所述cas9蛋白是superfi-cas9。
21.根据权利要求15所述的cas9蛋白，其中与spycas9(seq id no:68)对应的y1016、r1019、y1010、y1013、k1031、q1027和/或v1018残基突变为天冬氨酸。
22.根据权利要求2至15中任一项所述的方法，其中所述crispr蛋白融合至腺嘌呤碱基编辑器(abe)、胞苷碱基编辑器(cbe)或肌苷碱基编辑器(ibe)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述crispr融合至包含腺嘌呤或腺苷脱氨酶结构域或者胞苷或胞嘧啶脱氨酶结构域的碱基编辑器。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述crispr融合至包含腺嘌呤或腺苷脱氨酶结构域以及胞苷或胞嘧啶脱氨酶结构域的碱基编辑器。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述crispr蛋白包含核定位序列(nls)和/或flag、his或ha标签。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述crispr蛋白包含seq id no:1(spcas9)、seq id no:2(sacas9)或seq id no:3(cas12)中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个突变。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述突变是氨基酸取代。
28.根据权利要求26或27中任一项所述的方法，其中所述至少一个突变产生核酸酶失活的cas9(dcas9)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一个突变是cas9的ruvc结构域和/或hnh结构域中的一个或多个氨基酸取代。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一个突变是spcas9的氨基酸10处的天冬氨酸到丙氨酸的取代(d10a)，或其在cas9蛋白中的对应突变。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一个突变是spcas9的氨基酸840处的组氨酸到丙氨酸的取代(h840a)，或其在cas9蛋白中的对应突变。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述cas9蛋白具有切口酶活性。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述crispr蛋白融合至腺苷脱氨酶并且具有与seq id no:65至少80％相同的氨基酸序列。
34.根据权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述crispr蛋白融合至胞嘧啶脱氨酶中并且具有与seq id no:4至64至少80％相同的氨基酸序列。
35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中所述spcas9蛋白识别包含5'-ngg-3'、5'-nga-3'或5'-ngc-3'的pam序列。
36.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中所述sacas9蛋白识别包含5'-nnnrrt-3'或5'-nngrrt-3'的pam序列。
37.根据权利要求14和22至34中任一项所述的方法，其中所述cas12蛋白识别包含5'-rttn-3'的pam序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的人肝细胞已经在先前冷冻保存并随后解冻。
39.根据权利要求22至38中任一项所述的方法，其中与非基因修饰的人肝细胞相比，所述基因修饰的人肝细胞过表达cd47和/或cd142。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述基因修饰的人肝细胞移植到人源化动物模型中以用于扩增。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述人源化动物模型是frg猪、frg小鼠或frg大鼠。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中首先将所述基因修饰的人肝细胞移植到所述frg小鼠或frg大鼠中以用于初始细胞扩增。
43.根据权利要求42所述的方法，其中在所述初始细胞扩增之后，将基因修饰细胞随后移植到所述frg猪中以用于进一步的细胞扩增。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中初始扩增的细胞或进一步扩增的细胞是从动物中分离出来的。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述初始扩增的细胞或所述进一步扩增的细胞是通过荧光激活细胞分选、免疫磁性细胞分离、密度梯度离心和/或免疫密度细胞分离来分离的。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述基因修饰的人肝细胞具有一个、两个、三个或更多个核碱基编辑。
47.根据权利要求46所述的方法，其中单个碱基编辑器与一个以上的向导物组合产生所述两个、三个或更多个核碱基编辑。
48.根据权利要求46所述的方法，其中一个以上的碱基编辑器产生所述一个、两个、三个或更多个核碱基编辑。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与非基因修饰的人肝细胞相比，所述基因修饰的人肝细胞过表达cd47和/或cd142。
50.根据前述...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱塞佩·恰拉梅拉，J·M·格尔克，R·穆雷，
申请(专利权)人：比姆医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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