用于提高多肽产率的方法技术

本发明专利技术涉及用于提高蛋白质产率的方法。所述方法包括修饰一组相关蛋白质特征的数值，使其落入对真核宿主中一种或多种蛋白质特征而言的最适范围内，或者变得更接近对真核宿主中一种或多种蛋白质特征而言的最适值。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。特别地，本专利技术涉及通过修饰多肽主链来提高多肽产率的方法。
技术介绍
近期在基因组和宏基因组测序方面的迅速发展得到大量基因，它们代表着可能非常令人感兴趣的蛋白质财富。在显著水平下表达这些基因的问题妨碍了对这些基因编码的蛋白质功能性的探索，并因此阻止了以经济上可行的方式对此类蛋白质进行可能的开发。因为在许多情况下所发现的基因源自较不适合大规模生产的生物或者相当难以使用现有基因工程工具的生物，所以高度期望使用已被完善建立的生产宿主，所述生产宿主能够利用基因转移系统和充分开发的基因工程工具。特别地，真核生物例如丝状真菌和酵母在蛋白质生产、特别是细胞外蛋白质生产中被广泛用作细胞工厂。因为利用若干这些物种的长期传统是公认安全(GRAS)的，这使得它们对用于人使用的产品制造而言非常令人感兴趣。然而，尽管取得了大幅进步，但是针对异源基因获得的生产水平通常比针对同源基因所观察到的低得多。通常根本不存在蛋白质表达。存在用于提高蛋白质生产水平的多种技术。这些包括应用强启动子，提高拷贝数，最适Kozak序列，mRNA稳定化元件，优化的密码子使用(W02008/000632)和基因。然而这些策略通常不确保蛋白质能够以可检出的水平被生产。迄今为止生产异源蛋白质的最成功的途径是作为与有效分泌的同源蛋白质的翻译融合物来表达它们。然而，生产水平仍然显著落后，并且在许多情况下表达水平低得有问题。一般发酵中的低表达导致回收时的更低产率。即使表达被优化，最终的成熟蛋白质产物仍然可能因为下游加工的大量损失而导致非常低的生产产率。当被表达的蛋白质保持与生物量结合时可能是这种情况。这导致较高的损失，或者要求使用昂贵的、有时不期望地使用去污剂来溶解蛋白质。附图概沭图I图I展示了 K. Iactis表达载体pKLPGE_WT (构建描述于实施例I中)的质粒图谱。图I还提供了其它PKLPGE-表达质粒的代表性图谱。示出了相对于PEG编码基因的LAC4启动子和amdS选择标记物盒。可以在转化之前通过用限制性酶SacII消化来去除E. coli DNA。图2展示了表达载体pANPGE-3 (构建描述于实施例I中)的质粒图谱。图2还提供了其它PANPGE-表达质粒的代表性图谱。另外示出了 glaA启动子序列和截短的GlaA和PGE编码序列，所述编码序列编码根据本专利技术方法的变体PGE酶。在转化A.niger菌株之前可以通过用限制性酶NotI消化来去除E. coli DNA。图3展示了表达载体pGBFINZDU-WT (构建描述于实施例I中)的质粒图谱。图3还提供了其它pGBFINZDU-质粒、pGBFINZTB-质粒和pGBFINZTC-质粒的代表性图谱。示出了相对于amdS选择标记物盒的glaA侧翼区。另外还示出了 glaA启动子和编码根据本专利技术方法的变体酶的ZDU、ZTB和ZTC序列。在转化A. niger菌株之前可以通过用限制性酶NotI消化来去除E. coli DNA。、图4 对 A. niger WT6 和 PGE 突变体转化体 pANPGE12#16 ⑷和 pANPGE13#30 ⑶的SDS-PAGE和western印迹分析。分析培养物第2天(D2)和第3天(D3)的上清液。处于14kDa和97kDa的水平线用于对SDS-PAGE和Western印迹的校准。左手侧的标记物大小对应于SDS-PAGE染色的标记物,右手侧的标记物对应于Western印迹标记物。图5展示了发酵3天后表达不同ZDU构建体的A. niger菌株培养液中的几丁质酶活性，所述构建体均位于glaA启动子的控制下。展示了表达下述变体SDU构建体的A. niger菌株培养液中的几丁质酶活性，所述变体SDU构建体中信号序列、N-末端和蛋白质设计被修饰。关于不同构建体的细节可见表6。相对几丁质酶活性被展示为0D590测量值。对指出的所有转化体组而言，分离并独立培养了三种转化体。图6展示了对A. niger WT6和发酵4天后表达下述变体ZDU构建体的ZDU菌株的培养液的SDS-PAGE分析，所述变体ZDU构建体均位于glaA启动子的控制下。关于不同构建体和表达的ZDU蛋白质的细节可见于表6中。对示出的所有转化体组而言，分离并独立 培养了三种转化体。图7展示了对A. niger WT6和发酵4天后表达下述变体ZTB构建体的ZTB-菌株的培养液的SDS-PAGE分析，所述变体ZTB构建体均处于glaA启动子的控制下。关于不同构建体和表达的ZTB蛋白质的细节可见于表7中。对示出的所有转化体组而言，分离并独立培养了三种转化体。图8展示了对A. niger WT6和发酵5天后表达下述变体ZTC构建体的ZTC-菌株的培养液的SDS-PAGE分析，所述变体ZTC构建体均处于galA启动子的控制下。关于不同构建体和表达的ZTC蛋白质的细节可见于表8中。对示出的ZTC-WT转化体组而言，分离并独立培养了三种转化体，对其它两种菌株类型而言，分离并独立培养了两种菌株。图9展不了局部蛋白质特征。SEQ ID编号说明SEQ ID NO :I :cDNA 密码子对优化的(CPO)前胃酯酶(pregastric esterase,PGE);经加工的，即无信号序列编码部分SEQ ID NO :2 :蛋白质小牛前胃酯酶(PGE)，包括信号序列SEQ ID NO 3 DNA PGE蛋白质特征优化的(PFO)变体KL8，添加了 I个额外的糖基化位点SEQ ID NO :4 :蛋白质PGE PFO变体KL8，添加了 I个额外的糖基化位点SEQ ID NO 5 DNA PGE PFO变体KL9，添加了 5个额外的糖基化位点SEQ ID NO :6 :蛋白质PGE PFO变体KL9，添加了 5个额外的糖基化位点SEQ ID NO 7 DNA PGE PFO 变体 KLl I，pi 从 6. 96 迁移至 7. 74SEQ ID NO 8 :蛋白质 PGE PFO 变体 KLlI，pi 从 6. 96 迁移至 7. 74SEQ ID NO 9 DNA PGE PFO 变体 KL12，pi 从 6. 96 迁移至 6. 7SEQ ID NO: 10:蛋白质 PGE PFO 变体 KL12，pi 从 6. 96 迁移至 6. 7SEQ ID NO 11 DNA PGE，具有与a -MAT因子信号前(原_)序列融合的天然信号序列的PGE变体SEQ ID NO 12 DNA PGE AN3, CPO 基因 tAG 与 Kex 位点(KR)的融合物SEQ ID NO 13 DNA PGE 变体 AN12，pi 从 6. 96 迁移至 4. 6SEQ ID NO :14 :蛋白质 PGE 变体 AN12，pi 从 6· 96 迁移至 4· 6SEQ ID NO :15 DNA PGE 变体 AN13，pi 从 6· 96 迁移至 4· 88SEQ ID NO: 16 :蛋白质 PGE 变体 AN13，pi 从 6. 96 迁移至 4. 88SEQ ID NO :17 DNA 几丁质酶(ZDU)野生型SEQ ID NO 18 :蛋白质几丁质酶(ZDU)野生型SEQ ID NO 19 DNA 几丁质酶变体 ZDU-6S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：简·米特斯卡·拉恩·范德，吴亮，约翰尼斯·安德列什·劳博斯，鲁斯·帕拉尼克瓦，埃里克·皮特·洛斯，诺尔·尼克拉斯·玛利亚·伊丽莎白·佩吉·范，赫尔曼·扬·佩尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：