用于生产重组纤溶酶原和纤溶酶多肽的方法技术

本发明专利技术提供生产正确折叠的重组纤溶酶原和纤溶酶多肽的方法。变性的重组纤溶酶原多肽通过下述进行重折叠：首先在高ｐＨ用离液剂以及还原剂和氧化剂使多肽溶解，随后在减少浓度的离液剂以及还原剂和氧化剂的存在下以及在精氨酸的存在下重折叠。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 与相关申请的交叉参照本申请要求于2006年9月29日提交的临时专利申请美国序列号60/848， 456的优先权利益，所述专利申请整体引入作为参考。 关于联邦赞助的研究或开发的声明 不适用。专利
本专利技术涉及用于生产重组纤溶酶原多肽的方法。 专利技术背景 纤溶酶(Plm)是具有几种重要的生理学作用的丝氨酸蛋白酶，所述生理学作用包括溶解血块。纤溶酶通常以其酶原形式——纤溶酶原(Pig)在血液中惰性地循环，Plg为具有与新形成的血块结合的能力的791个氨基酸的单链糖蛋白(Mr 87KDa)。它的活化通过经由血块中捕获的组织纤溶酶原激活物(tPA)或尿激酶(uPA)消化精氨酸561和缬氨酸562之间的肽键(R5"^V562 )来实现。在这个肽键处的切割使单链蛋白质转化成通过2个必需二硫桥互联的2个分开的亚基。纤溶酶分子的A链由5个三环二硫化物kringle (Kr)结构域(各自约78-809氨基酸)组成，而B链包含20个氨基酸的"接头"区域和丝氨酸蛋白酶结构域(约228个氨基酸)。新近形成的纤溶酶活跃消化凝块中的纤维蛋白(fibrin)，从而使其溶解。 通过实验室操作，纤溶酶原的具有潜在的药理学用途的2个脱-kringle变体——小纤溶酶(miniPlm)和微纤溶酶(yPlm)在20年前得到阐述。MiniPlm仅由kringle-5结构域、接头和丝氨酸蛋白酶结构域组成，而yPlm仅由接头和丝氨酸蛋白酶结构域组成。MiniPlm通过用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶消化全长纤溶酶来产生(1，2)，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在缬氨酸441和缬氨酸442之间的肽键(V44"V442 )处特异性切割。ii Plm最初通过pH 11碱介导的全长纤溶酶在精氨酸530和赖氨酸531之间的肽键(RSMTK531 )断裂来产生(3，4)。在实验室中，iiPlm和miniPlm可以分别由其酶原前体微纤溶酶原(yPlg)和小纤溶酶原(miniPlg)，通过如对于纤溶酶原所描述的相同肽键处的切割来产生。类似地，在每种情况下都产生通过相同的2个二硫桥互联的2个分开的亚基。通过诱变去除这2个二硫桥中的任何一个或两个，都将使得活化的丝氨酸蛋白酶结构域丧无功能。 血栓溶解疗法中的近期进展部分地得到了导管设计和递送方面的显著技术进步的推动，这些技术进步允许实现向血块内直接的局部药物递送。这些革新特别与周围动脉闭塞疾病(PAOD)的治疗相关。在里程碑式的研究中，Novokhatny、Marder和同事(6， 7)能够在腹主动脉血栓形成的动物模型和体外模型中证实，在未受阻碍的血流过程中对于凝块的溶解，血清来源的纤溶酶等价于重组的组织纤溶酶原激活物(tPA)。更重要的是，在Plg底物得不到补充的受限血流的条件下，纤溶酶明显更佳。此外，在远离血栓位点的止血稳定的耳穿剌位点处，纤溶酶引起显著地更少的出血。纤溶酶的优点由于其相对于tPA明显更短的半衰期(在体内0. 02秒对 15分钟)而被认识到(8)。 这些研究对类似研究"打开了大门"，从而证实y Plm用于治疗PAOD和缺血性休克的效用。Nagai和同事(8)使用兔体外回路血栓溶解模型模拟PA0D并使用小鼠大脑中动脉模型模拟缺血性休克，比较了血清来源的纤溶酶、从巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中分离的重组y Plm和重组tPA的局部导管介导的递送，证实在凝块溶解方面有相似的功效。 纤溶酶一般从血液中进行分离。Nagai和同事已使用巴斯德毕赤酵母以高产率重组生产了 PPlg。 Nagai等人J. Thromb. Haemost. 1 :307-313,2003。 yPlg也已利用杆状病毒表达系统进行生产(5)，但具有相对低的产率。Wang等人，Protein Sci 4:1768-1779，1995。仍存在在制药规模上重组生产生物学活性的纤溶酶的需要。 用于使来自大肠杆菌(E.coli)包含体(inclusion body)的蛋白质重折叠的方法已得到报告。参见，例如，美国专利号6，583，268 ;美国公开号US 2003/070242 ;US2003/0199676 ;US 2004/0265298 ;和US 2005/0227920 ;以及PCT公开号WO 03/039491 ;W02004/094344 ;W0 01/55174 ;W02005/05830，这些参考文献中公开的方法包括通过使pH缓慢地从高pH降低到生理学pH来使蛋白质重折叠的步骤。 在此公开的所有参考文献、出版物和专利申请均完整地在此引入作为参考。 专利技术概述 本专利技术提供了用于生产生物学活性的重组纤溶酶原多肽的方法。这些重折叠的多肽可以用纤溶酶原激活物例如尿激酶进行处理，以产生生物学活性的纤溶酶用于医药用途。 本专利技术提供了用于使重组纤溶酶原多肽重折叠的方法，其包括(a)使纤溶酶原多肽溶解于溶解缓冲液中，所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂、还原剂、氧化还原剂，并具有约9. 0-约11. 0的pH，从而产生溶解的纤溶酶原多肽溶液；和(b)通过将所述溶解的纤溶酶原多肽溶液加入重折叠缓冲液内，用重折叠缓冲液快速稀释所述溶解的纤溶酶原多肽溶液，从而产生稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液，其中重折叠缓冲液包含精氨酸并具有约8. 0-约10. 0的pH ;和(c)温育稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液，从而产生重折叠的纤溶酶原多肽。纤溶酶原多肽可以在细菌细胞中进行表达，并且在包含体中的变性的多肽可以进行重折叠。 本专利技术还提供了通过本文描述的方法生产的生物学活性的纤溶酶原多肽和纤溶酶多肽。 本专利技术还提供了包含从细菌细胞例如大肠杆菌中生产的重折叠的纤溶酶原多肽的组合物。 本专利技术还提供了包含从细菌细胞例如大肠杆菌中生产的生物学活性的纤溶酶多肽的组合物(包括药物组合物)。 附图简述 图1显示纤溶酶原结构的图示。所指出的结构域是PAP，活化前肽(preactivation p印tide) ;A链kringles 1_5(K1_K5);禾口B链，催化结构域。 图2A显示在用IPTG诱导3小时后，包含P Pig或miniPlg的表达质粒的细胞的全细胞提取物的SDS-PAGE分析(具有P -ME还原)。泳道泳道1.丽标准；泳道2. y Plg-IPTG诱导；泳道3. ii Plg+IPTG诱导；泳道4. miniPlg-IPTG诱导；泳道5. miniPlg+IPTG诱导。 图2B显示纯化的y Pig和miniPlg包含体的SDS-PAGE (具有P _ME还原)分析。5泳道泳道1.丽标准；泳道2. ii Pig ;泳道3. miniPlg。 图3A显示最初由Wu等人在pH 11处理后产生的真实的(authentic)微纤溶酶和在实施例中使用的重组构建体(r-hu-iiPlg)的氨基酸序列。Wu等人，Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 84 :8292-8295， 1987 ;Wu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 :8793—8795，1987。编号系统源自全长纤溶酶。向下指的箭头指出真实的尿激酶活化切割位点RS"TvSW，而向上指的箭头指出经改造的人为尿激酶切割位点，以在激活后从分子上修剪掉质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于使重组纤溶酶原多肽重折叠的方法，其包括：　　（ａ）使纤溶酶原多肽溶解于溶解缓冲液中，所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂、还原剂、氧化还原剂，并具有约９．０－约１１．０的ｐＨ，从而产生溶解的纤溶酶原多肽溶液；和　　（ｂ）通过将所述溶解的纤溶酶原多肽溶液加入重折叠缓冲液中，用重折叠缓冲液快速稀释所述溶解的纤溶酶原多肽溶液，从而产生稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液，其中所述重折叠缓冲液包含精氨酸并具有约８．０－约１０．０的ｐＨ；和　　（ｃ）温育所述稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液，从而产生重折叠的纤溶酶原多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔺新力，D麦迪恩斯基，
申请(专利权)人：蛋白质组技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]