【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1.专利
本专利技术涉及重组多肽的生产。更具体而言,本专利技术涉及调节miRNA来提高产生重组多肽的细胞系的生产率,例如通过提高或降低一个或多个miRNA的水平。2.背景培养的哺乳动物细胞经常用于产生重组多肽。哺乳动物细胞培养提供优于非哺乳动物系统的许多优点,包括例如恰当的蛋白质折叠、组装以及翻译后修饰。然而,在提高大规模哺乳动物培养物的生产率的方面仍然存在挑战,包括例如与生长水平、细胞应激、以及翻译速率有关的挑战。在许多工业细胞培养过程中,在大型生物反应器中作为混悬液高密度地培养细胞,并且细胞往往会增殖超过它们的最优生长条件。在这些条件下,可能会触发细胞凋亡,并且因此细胞活力和生产率可能会降低。因此,许多生产优化策略依赖于防止细胞凋亡,并且通过增强培养基配制和生长条件来改变细胞代谢。最近研究表明细胞生产率可以通过改变调节多个重要细胞路径的关键分子如转录因子的全基因表达模式来提高。微小RNA(miRNA)是在植物和动物体内发现的具有约22个核苷酸的小的非编码的RNA分子,并且是基因表达的关键的转录和转录后调节剂。miRNA通过与mRNA分子内的互补序列进行碱基配对来起作用,从而经常导致基因沉默,并且这些miRNA涉及动物和植物体内包括与细胞生长、发育以及分化相关的调节功能的各种生物路径。miRNA在维持细胞内环境稳定和调节重要细胞路径如生长和细胞凋亡中发挥关键作用。不合适的miRNA表达与包括癌 ...
【技术保护点】
在哺乳动物细胞培养物中产生重组多肽的一种方法,该方法包括:(a)获得具有降低的miRNA‑let‑7a活性的哺乳动物细胞;(b)培养这些哺乳动物细胞以产生该重组多肽;并且(c)回收蛋白质。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.14 US 61/782,1801.在哺乳动物细胞培养物中产生重组多肽的一种方法,该方法包括:
(a)获得具有降低的miRNA-let-7a活性的哺乳动物细胞;
(b)培养这些哺乳动物细胞以产生该重组多肽;并且
(c)回收蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法,其中该miRNA-let-7a活性是被微小RNA抑
制剂降低。
3.如权利要求2所述的方法,其中该微小RNA抑制剂包括miRNA-let-7a
的反义寡核苷酸抑制剂。
4.如权利要求3所述的方法,其中该哺乳动物细胞培养物包括用miRNA-
let-7a的合成的反义寡核苷酸抑制剂转染的哺乳动物细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其中该寡核苷酸抑制剂被化学修饰来改进核
酸酶抗性,通过RISC提高对miRNA引导的裂解的抗性和/或提高结合亲和
力。
6.如权利要求1所述的方法,其中该哺乳动物细胞培养物包括用编码该
miRNA-let-7a的反义寡核苷酸抑制剂的表达载体转染的哺乳动物细胞。
7.如权利要求1所述的方法,其中该哺乳动物细胞培养物包括用miRNA-
let-7a的反义寡核苷酸抑制剂稳定地转染的哺乳动物细胞。
8.如权利要求1所述的方法,其中该哺乳动物细胞培养物包括用miRNA-
let-7a的反义寡核苷酸抑制剂瞬时地转染的哺乳动物细胞。
9.如权利要求1所述的方法,其中该哺乳动物细胞培养物包括选自以下各
项的哺乳动物细胞:中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、人
胚肾(HEK293)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞、人子宫颈癌
传代细胞、马丁达比犬肾(MDCK)细胞、CV1猴肾细胞、3T3细胞、骨髓
瘤细胞系、PC12、WI38细胞、猴肾成纤维细胞的COS-7系、以及C127。
10.如权利要求1所述的方法,其中这些哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细
胞。
11.如权利要求1所述的方法,其中这些哺乳动物细胞包括miRNA-let-7a基
因敲除。
12.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括抗体或它的结合片段。
13.如权利要求12所述的方法,其中该抗体或它的结合片段选自多特异性抗
体、完全的人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、
单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段、以及
抗独特型(抗Id)抗体。
14.如权利要求13所述的方法,其中该抗体或它的结合片段包括选自IgG、
IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY的同种型。
15.如权利要求13所述的方法,其中该抗体包括选自IgG1、IgG2、IgG3以
及IgG4的同种型。
16.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括非抗体蛋白。
17.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括融合蛋白。
18.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括受体。
19.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括细胞表面蛋白的一种配
体。
20.如权利要求19所述的方法,其中该细胞表面蛋白是受体。
21.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括分泌的蛋白。
22.如权利要求1所述的方法,其中该重组多肽包括酶。
23.如权利要求1所述的方法,其中该细胞培养物具有与不具有降低的
miRNA-let-7a活性的对照细胞培养物相比较增加至少约25%的比生产率。
24.如权利要求1所述的方法,其中该细胞培养物具有在峰值活细胞密度
(VCD)下确定的,与不具有降低的miRNA-let-7a活性的对照细胞培养物相
比较时增加至少约25%的最大生产率。
25.如权利要求1所述的方法,其中该细胞培养物具有与不具有降低的
miRNA-let-7a活性的对照哺乳动物细胞培养物相比较时增加的比生产率。
26.如权利要求1所述的方法,其中该细胞培养物的比生产率已增加至少
10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、
65%、70%或75%。
27.如权利要求1所述的方法,其中该细胞培养物具有与不具有降低的
miRNA-let-7a活性的对照细胞培养物相比较处在约1%与约30%之间的相对活
细胞密度。
28.如权利要求1所述的方法,其中在与不具有降低的miRNA-let-7a活性的
一种对照细胞培养物相比较时,细胞凋亡、蛋白质翻译或细胞代谢中的至少
一个介导因子的表达增加。
29.如权利要求24所述的方法,其中在与不具有降低的miRNA-let-7a活性
的对照细胞培养物相比较时,选自HMGA2、MYC、NF2、NIRF、RAB40C
以及eIF4a的miRNA-let-7a的至少一个靶标在该细胞培养物中的表达增加。
30.如权利要求2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员:K·施特赖歇尔,J·雅各布斯,R·W·乔甘塔斯三世,L·戈林里斯,K·拉纳德,M·鲍恩,
申请(专利权)人:米迪缪尼有限公司,
类型:发明
国别省市:美国;US
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