本发明专利技术公开了一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用。所述蛋白或多肽的植物表达载体序列如SEQ ID No.14所示，命名为载体pFolia40108。该表达载体基于芜菁脉明病毒(TVCV)的高度感染性和农杆菌对外源基因高效传递的特点，极大地提高了外源基因在烟草中的表达效率。本表达载体将TVCV基因组复制和胞间移动相关的基因克隆于穿梭载体pGreen，同时设计了含有IIs限制性内切酶BsaI的多克隆位点。通过本表达载体可以高效地表达各种抗体、多肽、酶等产品。
Plant expression vector of protein or polypeptide and application thereof
The invention discloses a plant expression vector of protein or polypeptide and application thereof. The protein or polypeptide of plant expression vector sequence of SEQ ID No.14, named as pFolia40108 carrier. The expression vector is based on the high infectivity of turnip vein virus (TVCV) and the high efficiency of exogenous gene transfer, which greatly improves the expression efficiency of exogenous gene in tobacco. This expression vector was cloned into the shuttle vector pGreen by cloning the genes related to TVCV genome duplication and cell migration, and the IIs containing restriction enzyme BsaI was designed. The expression vector can express various antibodies, peptides, enzymes, etc..
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用。
技术介绍
目前，应用植物反应器(植物悬浮细胞或整株植物)生产多肽产品、工业蛋白和医药蛋白，受到世界上很多国家的重视。由于植物体内体外均不含对人体有害的物质及病原菌，所以用植物生产要比用细菌及动物细胞生产安全得多，且生产过程中易于无菌管理，也无需从生产材料中除去有害物质，从而易于达到安全、低成本、大批量生产之目的。在植物中表达外源基因主要有两种途径，一种是用转基因的方法将外源基因整合入植物基因组进行稳定表达；另一种是应用植物病毒载体系统进行瞬时表达。与转基因植物相比，利用植物病毒载体表达外源基因具有如下优点：首先表达水平很高，伴随病毒的增殖，外源基因可高水平表达，甚至达到每千克病叶数克外源蛋白的水平；其次，植物病毒载体系统增殖速度快，也不需要耗时的植物遗传转化和再生过程，许多载体可通过机械接种感染大面积的植物，通常在接种后1-2周外源基因就可大量表达。与传统的细菌、酵母及动物细胞表达系统相比，植物病毒载体表达外源基因的优点还在于植物种植及管理技术简单，对人及动物安全，不需要昂贵的发酵及细胞培养等特殊设备，且能进行翻译后加工。DNA病毒最早用于植物病毒载体的构建，但复制过程的复杂性使这类病毒不适于在植物中高水平表达外源蛋白。自然界绝大多数植物病毒基因组由一个及多个正义RNA组成，它们的宿主范围广及病毒的滴度高，且具有在植物细胞内直接被翻译的能力，因此，利用RNA病毒在感染植株中表达重组蛋白日益受到重视。目前，已有多种RNA病毒家族成员用于构建病毒载体。如烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)、豇豆花叶病毒(cowpeamosaicvirus,CPMV)、番茄丛矮病毒(tomatobushystuntvirus,TBSV)、李痘病毒(plumpoxvirus,PPV)、马铃薯X病毒(potatovirusX,PVX)、苜蓿花叶病毒(alfalfamosaicvirus,ALMV)等。根据植物病毒基因组的结构与功能之特点，已有置换型(Genereplacement)、插入型(Geneinsertion)、互补型(Genecomplementation)及抗原展示型(Epitopepresentation)4种主要的植物病毒载体构建策略。置换策略最早用于病毒载体的构建，该策略是将外源基因置换病毒基因组中的非必须基因，但基因删除使置换策略存在很大的局限性。另一个有效方法为基因插入即在病毒基因组中插入外源基因。基因互补型载体是指将外源基因插入缺陷型病毒或亚病毒因子中，通过转基因植物或与辅助病毒共侵染而互补缺陷的功能。利用转基因植物互补缺陷型病毒载体失去的功能，从而表达外源基因或用来研究运功蛋白基因等多种病毒基因的功能，以克服置换型载体和插入型载体的不稳定性。抗原展示系统，是将外源基因选择性地插入病毒CP基因中融合表达，使小分子外源肽呈现在病毒粒子表面，通过提纯重组病毒即可获得大量的抗原。这种方法可以大大增强小蛋白多肽的免疫原性，弥补了小分子多肽单独作抗原时免疫原性弱的缺点，且表达的蛋白易于被哺乳动物免疫系统识别。但构建抗原展示型载体需要对病毒的基因组和外壳蛋白结构有充分的了解，因而仅被用于结构较为清楚的几种病毒，应用较多的是TMV、PVX、CPMV和TBSV等。烟草花叶病毒是一种在病毒学发展史各阶段都有重大影响的模式植物病毒，是螺旋对称型病毒的典型代表。TMV为单链正义RNA病毒，基因组RNA约6395个核苷酸，其RNA5’端有m7GpppG的帽状结构，3’端无poly(A)。病毒基因组RNA编码3个ORF，至少产生4个蛋白：126kDa，183kDa，30kDa和17kDa，其中17kDa蛋白为病毒的外壳蛋白(coatprotein,CP)，其余3个为非结构蛋白；183kDa和126kDa蛋白为RNA复制酶；30kDa蛋白是TMV的移动蛋白(movementprotein,MP)，与病毒在寄主体内的胞间移动有关。TMV最早被用于构建抗原展示载体。将亮氨酸(Leu)-脑啡肽(Enk)编码序列插入CP终止密码子的上游，但病毒核酸在植物细胞间不能移动，也不能形成病毒粒体。为解决这个问题，Hama-moto等进行了改进，他们将一个6bp的通读序列与外源的血管紧张素I转化酶抑制剂(ACEI)编码序列共同插入CP末端，这样能造成CP终止密码子(UAG)的通读，表达天然的CP和CP-ACEI融合蛋白，因而病毒载体能正常组装和系统侵染。利用这一策略流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原蛋白(gp120)也成功表达。但研究表明TMVCP仅能融合小于25个氨基酸的小肽，否则其组装会受到影响。TMV也被用于构建置换载体表达报告基因如gus，gfp，但多数情况下CP置换载体不能或仅能低水平表达外源基因。为了解决这一问题，一般是将额外的病毒CP亚基因组启动子引入该病毒基因组而将外源基因插入此启动子下游，但因为载体中双CP亚基因组启动子序列的高频同源重组，外源基因及易丢失。避免同源重组的方法是采用亲缘关系较近的病毒亚基因组启动子。基于这种思路，利用该病毒载体已表达了几种高价值蛋白分子。例如核糖体灭活蛋白(RIP)，a-天花粉蛋白，单链抗体(SCFV)及单克隆抗体等。并且，已有研究表明烟草花叶病毒载体可合成糖基化蛋白。利用烟草花叶病毒载体也表达了许多免疫性蛋白质包括口蹄疫病(FMDV)VP1蛋白，肿瘤SCFV抗原决定簇，牛疱疹病毒(BHV)gD蛋白及猪传染性腹泻病毒(PEDV)中和表位等。一些研究结果表明，多种植物病毒载体都存在一些问题：1)稳定性问题。植物病毒载体的一个最大的缺点在于它的稳定性差。快速的基因重组是病毒表达载体不稳定并丢失外源基因的主要原因。因此，在载体构建过程中要尽量避免出现同源序列，以防止发生基因重组。2)外源基因大小限制问题。置换载体插入外源基因的大小受被置换基因大小的限制，而插入载体表达中外源基因如果过大则可能导致表达困难或不能系统侵染。TMV、CPMV等融合抗原展示载体所能表达的外源小肽的大小更是受到严格限制，一般以10～20个氨基酸的多肽为宜，太大就会影响病毒的复制和组装，也为将来的提纯工作带来困难。3)安全性问题。病毒是植物重要的病原物，大部分病毒具有较广的寄主范围，尽管部分病毒载体已被修饰不能引起严重症状或被介体传播，但释放修饰和未修饰的病毒载体仍要严格管理。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述蛋白或多肽的植物表达载体序列如SEQIDNo.14所示，命名为载体pFolia40108。所述植物表达载体的构建方法为：首先构建载体pmGreen-BsaI；在载体pmGreen-BsaI基础上构建载体pmGreen-MCS；在pmGreen-MCS基础上构建载体pmGreen-RdRP-MP；定点突变载体pmGreen-RdRP-MP后获得载体pmGreen-RdRP-MPd；在载体pmGreen-RdRP-MPd基础上构建载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；构建载体pMD18-T-MNN；最后在载体pmGree本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白或多肽的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体序列如SEQ ID No.14所示，命名为载体pFolia40108。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白或多肽的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体序列如SEQIDNo.14所示，命名为载体pFolia40108。2.如权利要求1所述植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法为：首先构建载体pmGreen-BsaI；在载体pmGreen-BsaI基础上构建载体pmGreen-MCS；在pmGreen-MCS基础上构建载体pmGreen-RdRP-MP；定点突变载体pmGreen-RdRP-MP后获得载体pmGreen-RdRP-MPd；在载体pmGreen-RdRP-MPd基础上构建载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；构建载体pMD18-T-MNN；最后在载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM和载体pMD18-T-MNN基础上构建载体pFolia40108；所述载体pmGreen-BsaI序列如SEQIDNo.15所示，所述载体pmGreen-MCS序列如SEQIDNo.16所示，所述载体pmGreen-RdRP-MP序列如SEQIDNo.17所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd序列如SEQIDNo.18所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM序列如SEQIDNo.19所示，所述载体pMD18-T-MNN序列如SEQIDNo.20所示。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：(1)以pGreen载体为模板，通过SEQIDNo.1所示的正向引物和SEQIDNo.2所示的反向引物扩增后获得1#DNA片段；所述1#DNA片段序列如SEQIDNo.21所示；(2)用BamHI酶切1#DNA片段并回收，通过1#DNA片段的自连，环化得到载体pmGreen-BsaI；(3)合成序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条寡核苷酸链...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘炜松，吴川，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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